【文章內(nèi)容簡介】 2022年 8月 70 結(jié)果判斷指標(biāo) ? 在 3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)均不低于 70%。 ? 若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于 70%，按此該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。 ? 若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于 70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。 2022年 8月 71 常規(guī)法 ? 供試液的常規(guī)制備方法： 10g(ml)樣品加 pH 蛋白胨緩沖液至 100ml, 制成 1： 10供試液 2022年 8月 72 常規(guī)菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證過程 ? 試驗(yàn)組：取 1： 10供試液 1ml和菌液 1ml （ 50～ 100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 2022年 8月 73 ? 菌液組：取菌液 1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 ? 供試品對照組：取 1： 10供試液 1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 2022年 8月 74 結(jié)果判斷 ? 計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個試驗(yàn)菌的回收率均不低于 70%，按常規(guī)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于 70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。 2022年 8月 75 培養(yǎng)基稀釋法 ? 取規(guī)定量的供試液，加至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。 ? 1ml供試液可等量分注多個平皿。 ? 培養(yǎng)基稀釋法適用于抑菌作用不強(qiáng)的制劑。 2022年 8月 76 ? 在采用培養(yǎng)基稀釋法時 ， 應(yīng)注意避免在注皿前菌液和供試液直接接觸 ? 實(shí)驗(yàn)組 （ ； ） 每一平皿均應(yīng)加 1ml菌液 。 2022年 8月 77 以 1ml供試液平均分注 5個平皿的方法為例說明培養(yǎng)基稀釋法方法驗(yàn)證的過程 ? 10g(ml)樣品加 pH 蛋白胨緩沖液至 100ml, 制成 1： 10供試液 ? 供試液制備方法為常規(guī)法，無需進(jìn)行稀釋劑對照組的實(shí)驗(yàn) 2022年 8月 78 ? 試驗(yàn)組： 1ml 1:10的供試液等量分注 5皿，平行 2ml， 共 10皿，每皿各加 1ml 菌液。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（ A） ? 供試品組（本底組）： 1ml 1:10的供試液等量分注 5皿，平行 2ml， 共 10皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（ B） ? 菌液組：每皿加入 1ml菌液，平行 2皿。計(jì)算每皿平均菌數(shù)（ C） ? 回收率：（ AB） /C*100％ 2022年 8月 79 結(jié)果判斷： ? 計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率，若三次平行試驗(yàn)各個試驗(yàn)菌的回收率均不低于 70%，按培養(yǎng)基稀釋法測定供試品的細(xì)菌數(shù)（或霉菌及酵母菌數(shù)）。若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于 70%，應(yīng)采用其他方法，如薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。 2022年 8月 80 離心沉淀集菌法 ? 1： 10供試液的制備： 10g樣品加 pH 蛋白胨緩沖液至 100ml，混勻，低速離心（ 500rpm離 5分鐘）去渣，取上清 10ml高速離心（ 3000rpm離 20分鐘），離心后不要震搖離心管（一般用 10 ml帶有刻度的離心管），用注射器或吸管（注意不要插到 2ml刻度以下）吸取上面的 8 ml棄去，再加 8 ml稀釋液補(bǔ)充到 10 ml，混勻。 2022年 8月 81 ? 試驗(yàn)組：取 1： 10供試液 1ml和菌液 1ml （ 50～100cfu試驗(yàn)菌），分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 ? 菌液組：取菌液 1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 ? 供試品對照組：取 1： 10供試液 1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 2022年 8月 82 稀釋劑對照組： 取含菌稀釋液（含菌濃度為 50～ 100cfu /ml）代替供試品，經(jīng)過低速離心后轉(zhuǎn)移含菌稀釋液至另一離心管中，高速離心后，用與制備供試液相同的方法吸取離心管上層 8ml液體，再加 8 ml稀釋液補(bǔ)充到 10 ml，混勻。取此液體 1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 要保證稀釋劑對照組的操作過程與實(shí)驗(yàn)組完全相同！ 2022年 8月 83 不建議使用離心沉淀集菌法 ? 操作過程不小心極易造成菌體損失，使回收率降低。 ? 某些沉降系數(shù)低的細(xì)菌可能被漏檢，而驗(yàn)證試驗(yàn)無法對其驗(yàn)證。 ? 對某些抑菌性不強(qiáng)的樣品建議采用培養(yǎng)基稀釋法。 2022年 8月 84 薄膜過濾法 ? 供試品對照組：取規(guī)定量供試品，相當(dāng)于供試品 1g或 1ml，如 1： 10供試液取 10ml, 過濾，沖洗（確定沖洗量），取出濾膜，菌液面朝上貼在對應(yīng)培養(yǎng)基上，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 ? 試驗(yàn)組：過濾量，沖洗量同供試品對照組，在最后一次的沖洗液中加入 50～ 100cfu試驗(yàn)菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 2022年 8月 85 ? 菌液組：取菌液 1ml注入平皿中，傾注瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備 2個平皿，按平皿法測定其菌數(shù)。 ? 稀釋劑對照組：稀釋液 +1ml菌液混勻，過濾，沖洗（沖洗量及沖洗方法同試驗(yàn)組） ，取出濾膜，按薄膜過濾法測定其菌數(shù)。 2022年 8月 86 注意： ? 如回收率仍達(dá)不到 70%，首先考慮增加沖洗量，少量多次沖洗，不局限于藥典所說的每次沖洗100ml。 ? 可將待過濾的樣品稀釋至大量稀釋液中（如 : 500ml, 多少量需在驗(yàn)證資料中注明）再進(jìn)行過濾，這樣可以減少膜對樣品抑菌成分的吸附。 ? 沖洗速度不易過快，沖洗量不易過大。 ? 可與離心沉淀集菌法，中和法等方法聯(lián)用。 2022年 8月 87 其他消除抑菌效果的方法 ? β 內(nèi)酰胺類抗生素 β 內(nèi)酰胺酶 ? 奎諾酮類抗生素 2022年 8月 88 ? 當(dāng)最低稀釋級的供試液含有抑菌活性，且采用上述消除抑菌活性的方法后試驗(yàn)菌的回收率還無法達(dá)到計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求時，根據(jù)供試品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，可采用高一稀釋級的供試液重新進(jìn)行回收率的測定。若試驗(yàn)菌的回收率符合計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的要求，那么，進(jìn)行供試品細(xì)菌計(jì)數(shù)或霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)時，應(yīng)以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液 （中國藥典 2022 增補(bǔ)本擬增訂內(nèi)容） 2022年 8月 89 控制菌檢查方法驗(yàn)證 定性 —— 能否生長、專屬性實(shí)驗(yàn) ? 樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗(yàn)證 – 一般口服制劑驗(yàn)證大腸埃希菌 – 外用制劑驗(yàn)證金葡和銅綠 – 含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗(yàn)證 2022年 8月 90 試驗(yàn)菌株 ? 按規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)驗(yàn)證的菌株。 – 大腸菌群檢查用大腸埃希菌 – 梭菌檢查用生孢梭菌。 ? 菌種的要求：不得超過 5代。 ? 菌液制備為 10～ 100cfu/ml。 2022年 8月 91 ? 取規(guī)定量供試液及 10～ 100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。 ? 當(dāng)采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 2022年 8月 92 ? 設(shè)立陰性菌對照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性，方法同試驗(yàn)組。 ? 陰性對照菌不得檢出。 2022年 8月 93 控制菌 陰性對照菌株 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 大腸菌群 沙門菌 金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌 梭菌 2022年 8月 94 結(jié)果判斷 ? 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查。試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。 ? 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時進(jìn)行 2022年 8月 95 總結(jié)一般的驗(yàn)證過程： 第一步：常規(guī)法 第二步：培養(yǎng)基稀釋法 第三步：薄膜過濾法 在計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時先用常規(guī)法對 5種實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果某個或某些菌的回收率達(dá)不到 70%，繼續(xù)用它驗(yàn)證下一步的實(shí)驗(yàn)方法。直到它的回收率達(dá)到 70%以上。這時再用 5種菌進(jìn)行平行試驗(yàn)。 2022年 8月 96 關(guān)于驗(yàn)證菌中敏感菌的選擇 ? 相關(guān)文件 ? 選擇原則 2022年 8月 97 第七屆全國藥品檢驗(yàn)所抗生素室主任工作會議暨全國藥品微生物檢驗(yàn)方法及標(biāo)準(zhǔn)研討會會議紀(jì)要（微生物檢驗(yàn)部分） ? 為了進(jìn)一步理順方法驗(yàn)證和目前監(jiān)督抽驗(yàn)工作的關(guān)系，討論認(rèn)為應(yīng)對以建立科學(xué)合理的檢驗(yàn)方法為目的的方法驗(yàn)證試驗(yàn)和對監(jiān)督抽驗(yàn)工作中所采用抽驗(yàn)方法的有效性的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)加以區(qū)分，具體有如下三點(diǎn)： 2022年 8月 98 ? 1. 對于注冊檢驗(yàn)，如果沒有合理的檢驗(yàn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按照藥典要求，通過完整的驗(yàn)證試驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法及 SOP，所建立的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)確定具體的實(shí)驗(yàn)方法，如無菌檢查中的薄膜過濾法和直接接種法，微生物限度檢查中的平皿法和薄膜過濾法。標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中應(yīng)有關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)，如無菌檢查薄膜過濾法的沖洗條件；微生物限度檢查平皿法的供試品稀釋程度（ 、）。對有抗菌作用的樣品應(yīng)通過驗(yàn)證試驗(yàn)確定一株敏感菌株，以供采納該檢驗(yàn)方法時進(jìn)行方法的確認(rèn)使用。 2022年 8月 99 ? 2. 對注冊檢驗(yàn)中已有驗(yàn)證資料的方法進(jìn)行復(fù)核時，應(yīng)根據(jù)企業(yè)提供材料的情況，結(jié)合藥檢所掌握的情況，通過分析判斷、適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證等，保證驗(yàn)證資料中檢驗(yàn)方法的合理、可靠和科學(xué)。 2022年 8月 100 ? 3. 對于目前比較突出的已上市品種的監(jiān)督抽驗(yàn)問題，原則上應(yīng)向被抽驗(yàn)品種的生產(chǎn)單位索取方法驗(yàn)證資料，如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對照確認(rèn)或調(diào)整檢驗(yàn)方法。如果沒有及時獲得驗(yàn)證資料，或者驗(yàn)證資料中沒有確定敏感菌株，抗生素及抗菌品種可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進(jìn)行方法確認(rèn)試驗(yàn)，其他品種可從藥典驗(yàn)證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗(yàn)方法，一般細(xì)菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌，或其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可和檢驗(yàn)同步進(jìn)行。 2022年 8月 101 敏感菌株的選擇原則 ? 首先是個動態(tài)的選擇； ? 目前針對固定品種尚未有固定或法定的方法； ? 敏感菌株可以是一株菌，也可是兩株或更多； ? 敏感菌株不一定是藥典規(guī)定的驗(yàn)證用菌株； ? 由于新藥生產(chǎn)過程中的諸多不穩(wěn)定因素，對于注冊品種建議按照藥典規(guī)定菌株逐一進(jìn)行驗(yàn)證。 2022年 8月 102 針對抽驗(yàn)品種 ? 如資料中已確定有敏感菌株，可以該菌株為陽性對照確認(rèn)或調(diào)整檢驗(yàn)方法； ? 可根據(jù)其抗菌譜確立一株敏感菌株進(jìn)行方法確認(rèn)試驗(yàn)； ? 其他品種可從藥典驗(yàn)證菌株中選取一到兩株菌快速確立檢驗(yàn)方法； ? 一般細(xì)菌選擇枯草芽孢桿菌或金黃色葡萄球菌，真菌選擇白色念珠菌； ? 其他有可靠依據(jù)的敏感菌株，方法確認(rèn)實(shí)驗(yàn)可和檢驗(yàn)同步進(jìn)行。 2022年 8月 103 ? 抗厭氧菌的，應(yīng)選擇生孢梭菌； ? 抗革蘭氏陰性菌的，應(yīng)選擇大腸桿菌； ? 對無明顯抗菌活性的中藥品種（包括注射劑），我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)多對枯草芽孢桿菌較為敏感，而對霉菌不敏感； ? 建議中藥品種（包括注射劑），細(xì)菌首選擇枯草芽孢桿菌， 真菌選擇白色念珠菌。 2022年 8月 104 2022版 《 中國藥典 》 細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗(yàn)及方法建立 山東省藥品檢驗(yàn)所 濟(jì)南 2022年 8月 105 內(nèi)容 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素概述 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立的指導(dǎo)原則 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立與驗(yàn)證 ? 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 ? 附：中外藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法收載 及修訂情況 2022年 8月 106 細(xì)菌內(nèi)毒素概述 前言 細(xì)菌內(nèi)毒素 2022年 8月 107 一、前言