【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ℃培養(yǎng) h，用 ％無(wú)菌氯化鈉溶液 10 倍稀釋 105制成每 1ml含菌數(shù)為 50～ 100cfu 的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。 取新鮮的黑曲霉培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng) ℃培養(yǎng) d，加入 ml 含 %（ ml/ml）聚 山梨酯 80 的 ％無(wú)菌氯化鈉溶液，將霉菌孢子洗脫。然后吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無(wú)菌棉花或紗布能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）至無(wú)菌試管內(nèi)，用含 %（ ml/ml）聚山梨酯 80的 ％無(wú)菌氯化鈉溶液 10 倍稀釋 105制成每 1ml 含菌數(shù)為 50～ 100cfu 的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)備用。 、霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證試驗(yàn) 供試品對(duì)照組： 用滅菌注射器取少量 無(wú)菌氯化鈉 蛋白胨緩沖液注入滅菌薄膜過(guò)濾器，潤(rùn)濕濾膜，再取充分混勻的純化水樣 1ml 注入濾器，再用適量的 無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，使總沖洗量為 100ml,沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于已制備好的平板上， 按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)；細(xì)菌、霉菌及酵母菌各制備 2 個(gè)平皿。 菌液組： 分別取上述 5 種試驗(yàn)菌懸 驗(yàn)菌平行制備 2 個(gè)平皿，按平皿菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其菌數(shù)。 試驗(yàn)組： 取供試液 1ml，過(guò)濾，沖洗，分別在最后一次的沖洗液中加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、入白色念珠菌和黑曲霉試驗(yàn)菌懸液各 1ml，過(guò)濾，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每株試驗(yàn)菌平行制備 2個(gè)平皿， 按平皿菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其細(xì)菌數(shù) 稀釋劑對(duì)照組： 用相應(yīng)的稀釋液即 無(wú)菌氯化鈉 蛋白胨緩 沖液代替供使品，加入各試驗(yàn)菌 1ml，按實(shí)驗(yàn)組供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù) 。 陰性對(duì)照組：取實(shí)驗(yàn)用的稀釋液 1ml，制備濾膜，濾膜菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜，均不得有菌生長(zhǎng)。 備注：以上各菌懸液中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌用 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 作為細(xì)菌計(jì)數(shù)； 白色念珠菌和黑曲霉 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng) 作為霉菌酵母菌計(jì)數(shù)。 培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 以上各組中做細(xì)菌計(jì)數(shù)的平皿與 ℃倒置 培養(yǎng) 天，霉菌、酵母菌與 ℃倒置培養(yǎng) 天，逐日觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至 天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)別兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于 15，則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。 一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基用于霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有霉菌和酵母菌，玫 瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌和酵母菌，細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌落數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以 1 報(bào)告菌數(shù)，或 1 乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌落數(shù)。 計(jì)算回收率： 試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率（ %）＝（實(shí)驗(yàn)組的平均菌落數(shù) — 供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)） /菌液組的平均菌落數(shù) 100% 稀釋劑對(duì)照組的回收率（ %）＝ (稀釋劑對(duì)照 組平均菌落 /菌液組平均菌落數(shù)數(shù) )液各 1ml，分別注入平皿中，立即傾注培養(yǎng)基，每株試 100% 判斷標(biāo)準(zhǔn)： 本次試驗(yàn)各試驗(yàn)組的菌回收率和各稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均應(yīng)不低于 70%。 七 異常情況處理 嚴(yán)格按照《微生物限度檢查法 SOP》操作，如在檢測(cè)中有不符合要求的情況出現(xiàn)，分析問(wèn)題原因后，決定是否需對(duì)本方案中設(shè)定的微生物限度檢查方法進(jìn)行修改，并重新進(jìn)行驗(yàn)證。 八 測(cè)試結(jié)果 細(xì)菌、霉菌 及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)附表 1，此表三份次數(shù)分別為 3次。 九 結(jié)論 ： 十 再驗(yàn)證周期 國(guó)家相關(guān)微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)修改后需要對(duì)本方法重新進(jìn)行再驗(yàn)證。 附表一 附表一 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果 檢驗(yàn)日期： 試驗(yàn) 分類(lèi) 實(shí)驗(yàn) 次數(shù) 大腸埃希菌 金黃色 葡萄球菌 枯草芽孢 桿菌 白色念珠菌 黑曲霉菌 試驗(yàn)組 菌液組 稀釋劑對(duì)照組 供試品 對(duì)照組 陰性對(duì)照組 稀釋劑對(duì)照組菌回收率 試驗(yàn)組的 菌回收率 結(jié)果判定 結(jié)論： 檢驗(yàn)人： 復(fù)核人： 報(bào)告日期： 璽噱錐汰葡柔促汞甌芭踵篪猾餉鉿窗盜忮郯敞鏌唯范湖袤撮難蕓窆邏兜撾涫淺鉦馱拐萸涂拈搬碭雪河轄喜豎癇柔皋鉺栲急劐接琛究效操小炮鋈瓢樾暝嵯岸孓葸喃坨氦稼蘗孜撾撐櫻砧冕嶧噦妻朐弈媯朧淑嘴惴穌母膝增釁皆涼臌