【正文】 銅綠假單孢菌在室溫保存。 ⑵ 液體石蠟保藏法 本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、生化水平，延長菌種保藏時間。 方法：液體石蠟 121℃ 高壓滅菌30min 或 110170 ℃ 烘箱 12h干燥去掉水分。 取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入石蠟，高出培養(yǎng)基面 1cm為宜，在 4 ℃ 保藏。 ⑶ 冷凍真空保藏法 保護劑有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復 3次用脫脂棉過濾， 113 ℃ 高壓滅菌30min ，接入菌種，培養(yǎng)后低溫、冷凍、真空干燥置 35 ℃ 保存。 （ 4）甘油冷凍管保藏法 將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時間后（細菌 24～ 48小時的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時的培養(yǎng)物。），用無菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細菌充分擴散到預先裝于試管中的無菌蒸餾水中，調整菌液濃度，向已制備好的菌懸液中加入等體積 20％的無菌甘油，輕輕振搖小管，使內容物充分混和，分裝于無菌小管，制好的甘油冷凍管最好在－ 30℃ 貯存。 微生物廢棄物的滅活 廢棄的菌種、菌液、帶菌培養(yǎng)基以及帶菌器皿須經(jīng)過高壓（ 121℃ ）滅菌后方可處理。 無菌室管理制度 ? 1 無菌室的要求 ? 無菌室是專門進行藥品無菌、微生物限度檢查的試驗室，不得進行其他試驗，無菌檢查用無菌室與微生物限度檢查用無菌室應各自獨立。 ? 無菌室由更衣室、緩沖室及操作間組成。 ? 無菌室設連鎖式傳遞窗口，以保證人流物流分開。 ? 操作間應達到潔凈度 10， 000級，內設無菌凈化臺，潔凈度達到 100級。 ? 第二更衣室設有洗手盆。 ? 各房間設有照明燈，紫外燈。電源開關應設在室外。 ? 無菌室應有空氣凈化除菌的層流系統(tǒng)，保證試驗時空氣正壓。 ? 無菌試驗時無菌室的溫度應控制在 18～ 26℃ 范圍內，相對濕度應控制在 60%以下。 ? 2 無菌室的管理 ? 無菌室由專人管理 ? 無菌室應每半年檢測一次室內的潔凈度（塵埃粒子計數(shù)儀）并應符合要求，同時做好記錄。每一個月檢測一次室內的無菌度（平板計數(shù)法），應符合要求，同時做好記錄。 ? 無菌室內僅存放最必須的檢驗用具，保持固定位置，不隨意移動。 ? 3 無菌室的使用 ? 每次試驗前應用消毒劑擦拭工作臺面及可能污染的死角，開動空氣凈化系統(tǒng)及紫外燈殺菌 20～ 30分鐘。 ? 人員進入無菌室須經(jīng)更衣并洗手后方可進入無菌室。 ? 檢驗樣品及培養(yǎng)基等試驗物品進入試驗室必須通過傳遞窗，并在傳遞窗內經(jīng)紫外燈照射20～ 30分鐘。在操作間內除去物品的外包裝后進行試驗。 ? 根據(jù)檢測的情況決定是否用丙二醇進行空氣消毒，及更換濾器。 ? 每次試驗后同樣須用消毒劑擦拭工作臺面，及可能污染的死角，打掃干凈臺面、地面后繼續(xù)開動空氣凈化系統(tǒng)以除去室內的濕氣。 ? 每次試驗后應做好無菌室使用登記記錄。 菌種管理 ? 1 .菌種管理程序 菌種采購：源自中國藥品生物制品檢定所。 ? 2 . 每一支參照菌株都應以適當?shù)臉撕灅擞浕蚱渌麡擞浄绞? 來表示其名稱、標準號、接種日期和所傳代數(shù)。 ? 3 .菌種的復蘇：取購得的凍干菌粉加入適宜的液體培養(yǎng)基少許使之溶解，轉種于相應瓊脂斜面培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)，作為第一代菌。 ? 4 . 菌種的驗證：取上述培養(yǎng)物轉種于相應的選擇性培養(yǎng)基上，劃線分離單個菌落，在適宜的條件下培養(yǎng)。同時做革蘭氏染色涂片及生化實驗。 ? 5 . 菌種的選擇：選取上述經(jīng)驗證具有典型特征的菌種作為工作菌種。 ? 6 .菌種傳代：取上代菌種轉種于相應瓊脂斜面培養(yǎng)基上或半固體瓊脂培養(yǎng)基中，進行相應培養(yǎng)后，作為下一代菌種。 ? 7 . 菌種保存 ? 長期保存 需長期保存的菌種，用半固體瓊脂培養(yǎng)基保存法，于冰箱冷藏室（ 5℃ 177。 2℃ ）保存，保存期為 12年。 ? 短期保存 需定期傳代活化后使用的菌種，用相應瓊脂斜面培養(yǎng)基保存法，于冰箱冷藏室（ 5℃ 177。 2℃ ）保存，銅綠假單胞菌在室溫保存。保存期為 23月。 ? 8 .菌種復壯：如發(fā)現(xiàn)菌種特征不典型，應對其進行復壯。取需復壯的菌株接種于相應培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，轉種于相應的選擇性培養(yǎng)基上，適宜條件下培養(yǎng)，選擇典型菌落劃線于相應瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，做革蘭染色涂片及生化實驗進行驗證，選取經(jīng)驗證具有典型特征的菌種作為下一代菌種。 ? 9 .菌種傳代不得超過五代。超過五代及超過保存時間和復壯失敗的菌種需在121℃ 滅菌 30分鐘后處理。 ? 10 . 菌種管理記錄中應包括從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)，菌種生長的培養(yǎng)基及孵育條件，菌種的保存條件和銷毀。 今后無菌檢查工作的幾點建議： （針對實驗室管理者） 實驗周期的改變 — 培養(yǎng)時間的延長 檢驗的數(shù)量和檢驗量 方法學驗證及把握原則 黑曲霉菌液制備、接種和培養(yǎng)的問題 無菌室的潔凈度要求和管理 無菌重試的問題 HTY無菌隔離系統(tǒng) 片 7 國外隔離器照片 NKF型 培養(yǎng)器 應用原理： 溶解液瓶 西林瓶檢品 稀釋液