【正文】 銅綠假單孢菌在室溫保存。 ⑵ 液體石蠟保藏法 本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理、生化水平，延長(zhǎng)菌種保藏時(shí)間。 方法：液體石蠟 121℃ 高壓滅菌30min 或 110170 ℃ 烘箱 12h干燥去掉水分。 取經(jīng)培養(yǎng)的高層半固體菌管加入石蠟，高出培養(yǎng)基面 1cm為宜，在 4 ℃ 保藏。 ⑶ 冷凍真空保藏法 保護(hù)劑有多種，多用脫脂牛奶。將牛奶煮沸、靜止、冷卻除去上面一層脂肪，重復(fù) 3次用脫脂棉過(guò)濾， 113 ℃ 高壓滅菌30min ，接入菌種，培養(yǎng)后低溫、冷凍、真空干燥置 35 ℃ 保存。 （ 4）甘油冷凍管保藏法 將待保藏菌接種平板或瓊脂斜面，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間后（細(xì)菌 24～ 48小時(shí)的培養(yǎng)物，白色念珠菌72小時(shí)的培養(yǎng)物。），用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過(guò)接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝于試管中的無(wú)菌蒸餾水中，調(diào)整菌液濃度，向已制備好的菌懸液中加入等體積 20％的無(wú)菌甘油，輕輕振搖小管，使內(nèi)容物充分混和，分裝于無(wú)菌小管，制好的甘油冷凍管最好在－ 30℃ 貯存。 微生物廢棄物的滅活 廢棄的菌種、菌液、帶菌培養(yǎng)基以及帶菌器皿須經(jīng)過(guò)高壓（ 121℃ ）滅菌后方可處理。 無(wú)菌室管理制度 ? 1 無(wú)菌室的要求 ? 無(wú)菌室是專門進(jìn)行藥品無(wú)菌、微生物限度檢查的試驗(yàn)室，不得進(jìn)行其他試驗(yàn)，無(wú)菌檢查用無(wú)菌室與微生物限度檢查用無(wú)菌室應(yīng)各自獨(dú)立。 ? 無(wú)菌室由更衣室、緩沖室及操作間組成。 ? 無(wú)菌室設(shè)連鎖式傳遞窗口，以保證人流物流分開(kāi)。 ? 操作間應(yīng)達(dá)到潔凈度 10， 000級(jí)，內(nèi)設(shè)無(wú)菌凈化臺(tái)，潔凈度達(dá)到 100級(jí)。 ? 第二更衣室設(shè)有洗手盆。 ? 各房間設(shè)有照明燈，紫外燈。電源開(kāi)關(guān)應(yīng)設(shè)在室外。 ? 無(wú)菌室應(yīng)有空氣凈化除菌的層流系統(tǒng)，保證試驗(yàn)時(shí)空氣正壓。 ? 無(wú)菌試驗(yàn)時(shí)無(wú)菌室的溫度應(yīng)控制在 18～ 26℃ 范圍內(nèi)，相對(duì)濕度應(yīng)控制在 60%以下。 ? 2 無(wú)菌室的管理 ? 無(wú)菌室由專人管理 ? 無(wú)菌室應(yīng)每半年檢測(cè)一次室內(nèi)的潔凈度（塵埃粒子計(jì)數(shù)儀）并應(yīng)符合要求，同時(shí)做好記錄。每一個(gè)月檢測(cè)一次室內(nèi)的無(wú)菌度（平板計(jì)數(shù)法），應(yīng)符合要求，同時(shí)做好記錄。 ? 無(wú)菌室內(nèi)僅存放最必須的檢驗(yàn)用具，保持固定位置，不隨意移動(dòng)。 ? 3 無(wú)菌室的使用 ? 每次試驗(yàn)前應(yīng)用消毒劑擦拭工作臺(tái)面及可能污染的死角，開(kāi)動(dòng)空氣凈化系統(tǒng)及紫外燈殺菌 20～ 30分鐘。 ? 人員進(jìn)入無(wú)菌室須經(jīng)更衣并洗手后方可進(jìn)入無(wú)菌室。 ? 檢驗(yàn)樣品及培養(yǎng)基等試驗(yàn)物品進(jìn)入試驗(yàn)室必須通過(guò)傳遞窗，并在傳遞窗內(nèi)經(jīng)紫外燈照射20～ 30分鐘。在操作間內(nèi)除去物品的外包裝后進(jìn)行試驗(yàn)。 ? 根據(jù)檢測(cè)的情況決定是否用丙二醇進(jìn)行空氣消毒，及更換濾器。 ? 每次試驗(yàn)后同樣須用消毒劑擦拭工作臺(tái)面，及可能污染的死角，打掃干凈臺(tái)面、地面后繼續(xù)開(kāi)動(dòng)空氣凈化系統(tǒng)以除去室內(nèi)的濕氣。 ? 每次試驗(yàn)后應(yīng)做好無(wú)菌室使用登記記錄。 菌種管理 ? 1 .菌種管理程序 菌種采購(gòu)：源自中國(guó)藥品生物制品檢定所。 ? 2 . 每一支參照菌株都應(yīng)以適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽標(biāo)記或其他標(biāo)記方式 來(lái)表示其名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期和所傳代數(shù)。 ? 3 .菌種的復(fù)蘇：取購(gòu)得的凍干菌粉加入適宜的液體培養(yǎng)基少許使之溶解，轉(zhuǎn)種于相應(yīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)，作為第一代菌。 ? 4 . 菌種的驗(yàn)證：取上述培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上，劃線分離單個(gè)菌落，在適宜的條件下培養(yǎng)。同時(shí)做革蘭氏染色涂片及生化實(shí)驗(yàn)。 ? 5 . 菌種的選擇：選取上述經(jīng)驗(yàn)證具有典型特征的菌種作為工作菌種。 ? 6 .菌種傳代：取上代菌種轉(zhuǎn)種于相應(yīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上或半固體瓊脂培養(yǎng)基中，進(jìn)行相應(yīng)培養(yǎng)后，作為下一代菌種。 ? 7 . 菌種保存 ? 長(zhǎng)期保存 需長(zhǎng)期保存的菌種，用半固體瓊脂培養(yǎng)基保存法，于冰箱冷藏室（ 5℃ 177。 2℃ ）保存，保存期為 12年。 ? 短期保存 需定期傳代活化后使用的菌種，用相應(yīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基保存法，于冰箱冷藏室（ 5℃ 177。 2℃ ）保存，銅綠假單胞菌在室溫保存。保存期為 23月。 ? 8 .菌種復(fù)壯：如發(fā)現(xiàn)菌種特征不典型，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行復(fù)壯。取需復(fù)壯的菌株接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)種于相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上，適宜條件下培養(yǎng)，選擇典型菌落劃線于相應(yīng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，做革蘭染色涂片及生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，選取經(jīng)驗(yàn)證具有典型特征的菌種作為下一代菌種。 ? 9 .菌種傳代不得超過(guò)五代。超過(guò)五代及超過(guò)保存時(shí)間和復(fù)壯失敗的菌種需在121℃ 滅菌 30分鐘后處理。 ? 10 . 菌種管理記錄中應(yīng)包括從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)，菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及孵育條件，菌種的保存條件和銷毀。 今后無(wú)菌檢查工作的幾點(diǎn)建議： （針對(duì)實(shí)驗(yàn)室管理者） 實(shí)驗(yàn)周期的改變 — 培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) 檢驗(yàn)的數(shù)量和檢驗(yàn)量 方法學(xué)驗(yàn)證及把握原則 黑曲霉菌液制備、接種和培養(yǎng)的問(wèn)題 無(wú)菌室的潔凈度要求和管理 無(wú)菌重試的問(wèn)題 HTY無(wú)菌隔離系統(tǒng) 片 7 國(guó)外隔離器照片 NKF型 培養(yǎng)器 應(yīng)用原理： 溶解液瓶 西林瓶檢品 稀釋液