資料一核酸分離純化-資料下載頁
2025-05-13 01:59本頁面
【正文】 reagent LS：細胞懸浮液、其它液體標(biāo)本 TRI reagent RNA抽提操作流程： ? 組織勻漿（ 50mg tissue/ml TRI） ? 室溫靜置 5‘10’（細胞裂解過程） ? 加氯仿（ ），劇烈震蕩 15‘’ ? 室溫靜置 2‘3’（氯仿使蛋白變性） ? 4度 12021g, 15’ ? 取上清，加異丙醇 ()，混勻室溫靜置 15‘ ? 4度 12021g, 10’ ? 去上清， 75％乙醇洗沉淀 ? 風(fēng)干 , 15‘ ? 溶解，保存 RNA質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)： 測 A260/A280，要求 變性電泳檢測（參考條帶） 28S rRNA（ ~5kb） 18S rRNA（ ~2kb） 5S tRNA（ ~ kb） 補充說明： 原核生物 rRNA大小應(yīng)為 23S和 16S。 一般情況下， 28S(23S)與18S(16S)帶的亮度高 過柱法分離 RNA示意圖 分離原理 高鹽濃度情況下，硅石與DNA結(jié)合 低鹽濃度情況下，硅石與DNA分離 簡要流程 ? 結(jié)合 ? 洗滌 ? 洗脫 RNA抽提注意事項 RNA酶非常穩(wěn)定，抽提時需防止 RNA酶污染！ ? 盡可能無 RNA酶環(huán)境操作，最好有專門場所 ? 耗材的處理： 電泳槽： M NaOH處理后 DEPC水清洗 試管：氯仿浸泡處理后 DEPC水清洗 槍頭和 eppendorf管： DEPC水浸泡后滅菌處理 ? 實驗者本身防護：一次性手套，口罩等 ? 啟蓋前震蕩離心管有助于防止氣溶膠形成 ? 正確的操作方式 RNA抽提常見問題分析（一） Q過柱抽提時柱子堵塞 裂解或勻漿出來不徹底：較少樣品用量或增加裂解液用量，增加勻漿和裂解時間 Q得率低 A、裂解或勻漿出來不徹底：較少樣品用量或增加裂解液用量，增加勻漿和裂解時間 B、 RNA收集不完全：過柱法： RNA未完全洗脫，加入洗脫液后放置幾分鐘再離心 溶液法： 65度加熱促進 RNA沉淀溶解 C、未除盡細胞培養(yǎng)液：收集細胞時需盡量除去培養(yǎng)液 D、使用 RNAstore保存的細胞：未有效離心，加大離心力（ 3000g）除去 RNAlater Q DNA污染 勻漿時，樣本太多，而抽提液使用量太小 Q蛋白、多糖污染 RNA沉淀時，加入部分鹽溶液，選擇性沉淀 RNA RNA抽提常見問題分析（二） Q A260/A280比值過低 A、 勻漿時，樣本太多，而抽提液使用量太?。ㄈ芤悍ǎ? B、 勻漿后，樣本沒有放置室溫靜置 5分鐘（溶液法） C、 水相中可能有酚殘留（溶液法） D、 RNA沉淀溶解不充分（溶液法） E、 RNA溶解在 DEPC水而非 TE溶液中，低離子濃度和 PH值增加 280nm吸光值 Q RNA降解 A、取樣操作不正確，取樣后應(yīng)立即抽提和凍存 B、樣本保存不當(dāng) C、液相中可能有 RNA酶污染 D、制膠時所有甲醛的 PH值小于 mRNA分離原理： Dynabeads Oligo(dT)25是 的磁性微球，與 poly(A)配對， 15分鐘就可以完成分離過程。 聯(lián)系我們 深圳中晶生物技術(shù)有限公司 地址：深圳市南山區(qū)高新科技園 免費電話： 800 830 6470 Tel: +86 755 86313122 Fax: +86 755 86313266 Email: 網(wǎng)址：
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