【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 量，一般以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器量進(jìn)行確定。在分離度試驗(yàn)基礎(chǔ)上如有可能可進(jìn)行重復(fù)性、中間精密度、專(zhuān)屬性、定量限、線(xiàn)性范圍、耐用性、測(cè)定溶液穩(wěn)定性等的研究。薄層色譜法用于已知雜質(zhì)檢查時(shí)，宜采用與一定量的已知雜質(zhì)對(duì)照品，同點(diǎn)樣于同一薄層板上，展開(kāi)后檢測(cè)；用于未知雜質(zhì)時(shí)，可將供試品溶液定量稀釋后作為對(duì)照溶液，但應(yīng)注意雜質(zhì)斑點(diǎn)與自身對(duì)照的呈色要有可比性，結(jié)果判斷除控制雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)與限度外，可用兩種以上不同濃度的對(duì)照溶液分別檢測(cè)比較。高效液相色譜法作雜質(zhì)檢查，也可與含量測(cè)定同時(shí)進(jìn)行，所用色譜柱首先考慮通用柱（十八烷基硅烷鍵合硅膠，硅膠及辛基烷鍵合硅膠）。如分離不好，可選用其他柱，但應(yīng)附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，說(shuō)明理由，如經(jīng)對(duì)比，必須用指定牌號(hào)的色譜柱或填充劑則應(yīng)注明，應(yīng)采用價(jià)廉易得的流動(dòng)相，應(yīng)首選甲醇一水系統(tǒng)，如需用少量酸堿調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，應(yīng)明確規(guī)定pH值及范圍，如為堿性藥物流動(dòng)相的pH值應(yīng)為7 – 8；如為酸性藥物，流動(dòng)相pH值應(yīng)為3 – 4。并盡可能選用流動(dòng)相作為溶劑，如未能選用，應(yīng)說(shuō)明原因。檢測(cè)器則應(yīng)首選UV– 可見(jiàn)光檢測(cè)器。HPLC法用于測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，參照中國(guó)藥典現(xiàn)行版附錄的要求，并根據(jù)條件和可能選擇：⑴ 雜質(zhì)對(duì)照法，⑵ 加校正因子的自身對(duì)照法，⑶ 不加校正因子的自身對(duì)照法，由于不同物質(zhì)響應(yīng)因子可能不同，因此盡可能采用⑴ ⑵ 法，當(dāng)雜質(zhì)峰的響應(yīng)值與主成分峰的響應(yīng)值相差太大時(shí)，應(yīng)選用自身對(duì)照法，而不宜選用面積歸一法，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇時(shí)應(yīng)選擇主成分峰與雜質(zhì)峰響應(yīng)值盡量相當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，作為檢測(cè)波長(zhǎng)。氣相色譜法的常用固定相為SE系列、OV系列、PEG系列等，擔(dān)體首選白色并經(jīng)酸洗后硅烷化擔(dān)體，也可選用其他固定相和擔(dān)體。檢測(cè)器首選氫火焰離子化檢測(cè)器。如單憑色譜法檢查雜質(zhì)尚欠充分時(shí)，可用聯(lián)機(jī)技術(shù)如HPLC/UV二極管陣列，HPLC/MS或GC/MS對(duì)待測(cè)雜質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。有關(guān)物質(zhì)的限量，如分離出有幾個(gè)雜質(zhì)峰（或點(diǎn)）可考慮制訂總雜質(zhì)限度和單個(gè)最大雜質(zhì)的限度；或制訂已知雜質(zhì)限度，未知雜質(zhì)限度和單雜質(zhì)限度計(jì)算方法可采用對(duì)照品法加校正因子的自身對(duì)照法，不加校正因子的自身對(duì)照法或根據(jù)不同雜質(zhì)采用不同方法。干燥失重與水分“干燥失重”系指在規(guī)定的條件下，測(cè)定藥物中所含能被驅(qū)去的水或其他揮發(fā)性物質(zhì)。水分系指用費(fèi)休氏法或甲苯法測(cè)得藥品中的殘留水和結(jié)晶水的總和，但不包括其他揮發(fā)性物質(zhì)，為了真實(shí)反映含量，一般均應(yīng)加以規(guī)定，尤其是對(duì)具有吸濕性或含有結(jié)晶水，以及因含水量高將影響其穩(wěn)定性的藥品，更應(yīng)訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。含結(jié)晶水的，并因風(fēng)化失水過(guò)多時(shí)將影響用藥劑量的藥物，應(yīng)制訂高低范圍。遇熱易變色破壞或分解的藥品宜采用費(fèi)休氏水分測(cè)定法或減壓干燥法測(cè)定。熾灼殘?jiān)抵噶蛩峄曳郑赞D(zhuǎn)化成硫酸鹽的重量計(jì)算，用以考查有機(jī)藥物中混入的各種無(wú)機(jī)雜質(zhì)，是控制無(wú)機(jī)雜質(zhì)的一種簡(jiǎn)便方法；因取樣量大，對(duì)用藥劑量小而又價(jià)格昂貴的藥品，一般可不訂入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但應(yīng)提供研究的數(shù)據(jù)。金屬離子和重金屬藥物中對(duì)某單一金屬離子的檢查，不同于重金屬檢查，是有其針對(duì)性的，如鋇鹽對(duì)人體有毒，鐵鹽能加速藥物的氧化、降解；因此根據(jù)所用原料和生產(chǎn)工藝，制訂檢查的內(nèi)容和要求。檢測(cè)方法一般可采用原子吸收分光光度法（如鉀、鈉、鈣、鋅）、比濁法或比色法（如銅、鎳、鉛等）。重金屬系指在規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下，能與硫代乙酰胺試液或硫化鈉作用顯色的雜質(zhì)，用以檢查藥物是否污染上金屬離子；要作本項(xiàng)檢查的除有特殊要求外， 或以上，并長(zhǎng)期給藥的品種，不要作為對(duì)藥品質(zhì)量的普遍要求。一般有四種測(cè)定方法：第一法為最常用的方法，一般用于水溶性藥物；在水中不溶的可改用乙醇。第二法適用于不溶于水或乙醇的藥物，或因自身有顏色，可取熾灼殘?jiān)?xiàng)下遺留的殘?jiān)M(jìn)行檢查。第三法是在堿性條件下，用硫化鈉試液作為顯色劑的檢查方法，主要用于溶解于堿而不溶于酸的有機(jī)藥物的檢查。第四法為微孔薄膜法，可避免供試品原有顏色的干擾，靈敏度高， – 5ug 的梯度明顯，取用量中的pb宜在2 – 4ug，可推廣應(yīng)用。硒或砷鹽硒和砷均為毒性雜質(zhì)，可按中國(guó)藥典現(xiàn)行版附錄規(guī)定的方法，進(jìn)行檢測(cè)。硒一般需采用氧瓶燃燒法進(jìn)行有機(jī)破壞后，用分光光度法，與對(duì)照品溶液對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)。砷鹽有二種測(cè)定法，第一法為古蔡氏法。對(duì)于具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)藥物，因砷有可能以其價(jià)鍵結(jié)合在雜環(huán)分子中，需經(jīng)有機(jī)破壞后檢查，第二法為二乙基二硫代氨基甲酸銀比色法，不僅咳用于限度檢查，也可用作微量砷鹽測(cè)定。對(duì)于一些外用藥或藥量較少的口服藥，可少用此項(xiàng)檢查。1安全性試驗(yàn)藥品中存在的某些痕量雜質(zhì)，可對(duì)人體產(chǎn)生特殊的生理作用，抗生素藥品或供注射用原料藥，必要性應(yīng)檢查異常毒性、熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素、過(guò)敏性雜質(zhì)、降壓物質(zhì)與無(wú)菌等項(xiàng)。綜上所述，藥品純度檢驗(yàn)，包括的內(nèi)容眾多，在進(jìn)行藥品質(zhì)量研究時(shí)可根據(jù)研制藥物的性質(zhì)及要求，進(jìn)行擇要的考察。除用文字記述外，也可列表說(shuō)明，如表表表6。表4 檢查項(xiàng)目測(cè)定數(shù)據(jù) 批號(hào) 020115 020116 020117 020118項(xiàng)目溶液澄清度 澄清 相當(dāng)于1號(hào) 相當(dāng)于2號(hào) 相當(dāng)于1號(hào) 標(biāo)準(zhǔn)比濁液 標(biāo)準(zhǔn)比濁液 標(biāo)準(zhǔn)比濁液酸度 氯化物 100ppm 120ppm 80ppm 50ppm熾灼殘?jiān)? % % % %吡啶 100ppm 50ppm 80ppm 60ppm干燥失重 % % % %有關(guān)物質(zhì) % % % %(HPLC)（一）化學(xué)藥物雜質(zhì)研究 任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為雜質(zhì)。雜質(zhì)的研究是藥品研發(fā)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。應(yīng)參照《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》。本項(xiàng)研究包括選擇合適的分析方法準(zhǔn)確地分辨與測(cè)定雜質(zhì)的含量并綜合藥學(xué)、毒理及臨床研究的結(jié)果確定雜質(zhì)的合理限度。這一研究貫穿于藥品研發(fā)的整個(gè)過(guò)程。 由于藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應(yīng)除了與藥品本身的藥理活性有關(guān)外，有時(shí)與藥品中存在的雜質(zhì)也有很大關(guān)系。例如，青霉素等抗生素中的多聚物等高分子雜質(zhì)是引起過(guò)敏的主要原因。所以規(guī)范地進(jìn)行雜質(zhì)的研究，并將其控制在一個(gè)安全合理的限度范圍之內(nèi)，將直接關(guān)系到上市藥品的質(zhì)量及安全性。 由于此項(xiàng)研究探索性很強(qiáng)，希研究單位在科學(xué)合理的基礎(chǔ)上對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行研究，用科學(xué)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)證明藥品中存在的雜質(zhì)可被控制在安全、合理的范圍內(nèi)就達(dá)到了雜質(zhì)研究的目的。1．雜質(zhì)的分類(lèi)毒性雜質(zhì)（具強(qiáng)烈不良生物作用）普通雜質(zhì)（在存在量下無(wú)顯著不良生物作用）毒性其他甾體，其他生物堿、幾何異構(gòu)體、聚合物結(jié)構(gòu)有關(guān)物質(zhì)（包括化學(xué)反應(yīng)的前體，中間體，付產(chǎn)物，降解產(chǎn)物等）其他雜質(zhì)，外來(lái)物質(zhì)來(lái)源有機(jī)雜質(zhì)、無(wú)機(jī)雜質(zhì)、有機(jī)揮發(fā)性雜質(zhì)化學(xué)類(lèi)別和特性分類(lèi)依據(jù) 一般主要按照雜質(zhì)的理化性質(zhì)分類(lèi)： 有機(jī)雜質(zhì)包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物等，由于這類(lèi)雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)一般與活性成份類(lèi)似或具有淵源關(guān)系，通常又可稱(chēng)之為有關(guān)物質(zhì)。 無(wú)機(jī)雜質(zhì)通常是已知的，主要包括：反應(yīng)試劑、配位體、催化劑、重金屬、其他殘留的金屬、無(wú)機(jī)鹽、活性炭等。 殘留溶劑是指在原料藥、輔料及制劑生產(chǎn)過(guò)程中使用的有機(jī)溶劑。其研究應(yīng)參照《有機(jī)溶劑殘留量研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》和“殘留溶劑測(cè)定法”（中國(guó)藥典2005年版附錄ⅧP）。2．有機(jī)雜質(zhì)的檢測(cè)方法包括化學(xué)法、光譜法、色譜法等，因藥物結(jié)構(gòu)及降解產(chǎn)物的不同采用不同的檢測(cè)方法。通過(guò)合適的分析技術(shù)將不同結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)雜質(zhì)的有效控制。目前普遍采用的雜質(zhì)檢測(cè)方法主要為高效液相色譜、薄層色譜法、氣相色譜法和毛細(xì)管電泳法。 應(yīng)根據(jù)藥物及雜質(zhì)的理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)的控制要求等確定適宜的檢測(cè)方法。由于各種分析方法均具有一定的局限性，因此在進(jìn)行雜質(zhì)分析時(shí)，應(yīng)注意不同原理的分析方法間的相互補(bǔ)充與驗(yàn)證。 3．雜質(zhì)檢測(cè)方法的驗(yàn)證重點(diǎn)在于專(zhuān)屬性和靈敏度的驗(yàn)證。 專(zhuān)屬性系指在其他成份可能共存的情況下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)出被測(cè)雜質(zhì)的特性。 檢測(cè)限是反映分析方法靈敏度的一個(gè)重要指標(biāo)，系指分析方法能檢測(cè)藥品中被測(cè)雜質(zhì)的最低濃度，但不必定量。 對(duì)于原料藥，可根據(jù)其合成工藝，采用各步反應(yīng)的中間體（尤其是后幾步反應(yīng)的中間體）、立體異構(gòu)體、粗品、重結(jié)晶母液等作為測(cè)試品進(jìn)行系統(tǒng)適用性研究，考察產(chǎn)品中各雜質(zhì)峰及主成分峰間的分離度是否符合要求，從而驗(yàn)證方法對(duì)工藝雜質(zhì)的分離能力。 為了考察方法能否有效檢測(cè)出原料藥或制劑中的降解產(chǎn)物，可根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、制劑的處方與工藝，貯存條件等選用合適的酸、堿、光、熱氧化反應(yīng)等加速破壞性試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證分析方法的專(zhuān)屬性，必要時(shí)可采用二極管陣列檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器等檢測(cè)峰的純度。 強(qiáng)制降解試驗(yàn)對(duì)于未知雜質(zhì)的分離度考察是非常必要的，其目的主要是提供關(guān)于雜質(zhì)（特別是降解物）與主成分的分離情況、樣品穩(wěn)定性及降解途徑等重要信息。破壞試驗(yàn)的程度暫無(wú)統(tǒng)一要求，一般以強(qiáng)力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜。此時(shí)已產(chǎn)生了一定量的降解產(chǎn)物，與樣品長(zhǎng)期放置的降解情況相似，考察此情況下的分離度更具有實(shí)際意義。 4．有機(jī)雜質(zhì)的定量方法： 有機(jī)雜質(zhì)的檢測(cè)方法一般多采用HPLC法，有時(shí)也采用TLC、GC等其他方法。 如采用HPLC法，須采用峰面積，具體定量方法有①外標(biāo)法（雜質(zhì)對(duì)照品法）；②加校正因子的主成份自身對(duì)照法；③不加校正因子的主成份自身對(duì)照法；④峰面積歸一化法。 ①法定量比較準(zhǔn)確，采用時(shí)應(yīng)對(duì)對(duì)照品進(jìn)行評(píng)估和確認(rèn)，并制訂質(zhì)量要求。②法應(yīng)對(duì)校正因子進(jìn)行嚴(yán)格測(cè)定，僅適用于已知雜質(zhì)的控制。③法的前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同（雜質(zhì)對(duì)主成份的相對(duì)晌應(yīng)因子在0．9—1．1范圍內(nèi)）。 ④法簡(jiǎn)便快捷，但因各雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線(xiàn)性范圍內(nèi)、儀器對(duì)微量雜質(zhì)和常量主成分和積分精度及準(zhǔn)確度不相同等因素，所以在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用有一定的局限性。 5．雜質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的積累 雜質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的積累是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)限度的重要依據(jù)之一，它包括藥品研制過(guò)程中所有批次樣品（包括用于安全性、臨床研究的樣品）的雜質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)。 檢測(cè)結(jié)果應(yīng)提供具體數(shù)據(jù)（如雜質(zhì)的保留時(shí)間及含量），不能籠統(tǒng)地表述為“符合要求”或合格等。建議用表格的形式，列出產(chǎn)品批號(hào)、生產(chǎn)日期、單個(gè)雜質(zhì)及總雜質(zhì)的含量并應(yīng)提供色譜圖。馬來(lái)酸羅格列酮有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果1．10．950．931．10．98總雜質(zhì)（%）0．350．380．320．300．30雜質(zhì)Ⅱ（%）0．460．560．500．540．52雜質(zhì)Ⅰ（%）（未還原物）7．387．407．367．387．397．482．802．792．752．782．812．65保留時(shí)間（分）羅格列酮馬來(lái)酸080228080218080211080202080107批號(hào) 方法學(xué)研究中雜質(zhì)分離度和檢測(cè)限的圖譜、代表性批次的圖譜、采用其它雜質(zhì)檢測(cè)方法所得的圖譜、加速及長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)的圖譜等，可以輔助說(shuō)明產(chǎn)品中雜質(zhì)的概況。表5 異構(gòu)體分離的色譜條件篩選 因素 色譜柱 流動(dòng)項(xiàng) 柱溫 結(jié) 果圖號(hào)1A 手性色譜柱 乙腈一水 室溫 拖尾因子 (55:45) , 2A 手性色譜柱 乙腈一水 15℃ 拖尾因子 (60:40) , 3A 手性色譜柱 乙腈一水 30℃ 拖尾因子 (60:40) , 表6 降解破壞性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 條件 降解方法 結(jié) 果圖號(hào)1A 取供試品溶液2ml,加2%氫氧化鈉 主峰與3個(gè)雜質(zhì)峰分離 溶液10ml,室溫放置10小時(shí)2A 取供試品溶液2ml,加1%鹽酸 主峰與所有雜質(zhì)峰分離 溶液10ml,室溫放置6小時(shí)3A 取供試品溶液