【文章內(nèi)容簡介】 量，一般以信噪比為10：1時相應(yīng)的濃度或注入儀器量進行確定。在分離度試驗基礎(chǔ)上如有可能可進行重復(fù)性、中間精密度、專屬性、定量限、線性范圍、耐用性、測定溶液穩(wěn)定性等的研究。薄層色譜法用于已知雜質(zhì)檢查時，宜采用與一定量的已知雜質(zhì)對照品，同點樣于同一薄層板上，展開后檢測；用于未知雜質(zhì)時，可將供試品溶液定量稀釋后作為對照溶液，但應(yīng)注意雜質(zhì)斑點與自身對照的呈色要有可比性，結(jié)果判斷除控制雜質(zhì)斑點數(shù)與限度外，可用兩種以上不同濃度的對照溶液分別檢測比較。高效液相色譜法作雜質(zhì)檢查，也可與含量測定同時進行，所用色譜柱首先考慮通用柱（十八烷基硅烷鍵合硅膠，硅膠及辛基烷鍵合硅膠）。如分離不好，可選用其他柱，但應(yīng)附實驗數(shù)據(jù)，說明理由，如經(jīng)對比，必須用指定牌號的色譜柱或填充劑則應(yīng)注明，應(yīng)采用價廉易得的流動相，應(yīng)首選甲醇一水系統(tǒng)，如需用少量酸堿調(diào)節(jié)流動相的pH值，應(yīng)明確規(guī)定pH值及范圍，如為堿性藥物流動相的pH值應(yīng)為7 – 8；如為酸性藥物，流動相pH值應(yīng)為3 – 4。并盡可能選用流動相作為溶劑，如未能選用，應(yīng)說明原因。檢測器則應(yīng)首選UV– 可見光檢測器。HPLC法用于測定雜質(zhì)含量時，參照中國藥典現(xiàn)行版附錄的要求，并根據(jù)條件和可能選擇：⑴ 雜質(zhì)對照法，⑵ 加校正因子的自身對照法，⑶ 不加校正因子的自身對照法，由于不同物質(zhì)響應(yīng)因子可能不同，因此盡可能采用⑴ ⑵ 法，當雜質(zhì)峰的響應(yīng)值與主成分峰的響應(yīng)值相差太大時，應(yīng)選用自身對照法，而不宜選用面積歸一法，檢測波長選擇時應(yīng)選擇主成分峰與雜質(zhì)峰響應(yīng)值盡量相當?shù)牟ㄩL，作為檢測波長。氣相色譜法的常用固定相為SE系列、OV系列、PEG系列等，擔體首選白色并經(jīng)酸洗后硅烷化擔體，也可選用其他固定相和擔體。檢測器首選氫火焰離子化檢測器。如單憑色譜法檢查雜質(zhì)尚欠充分時，可用聯(lián)機技術(shù)如HPLC/UV二極管陣列，HPLC/MS或GC/MS對待測雜質(zhì)進行定性和定量分析。有關(guān)物質(zhì)的限量，如分離出有幾個雜質(zhì)峰（或點）可考慮制訂總雜質(zhì)限度和單個最大雜質(zhì)的限度；或制訂已知雜質(zhì)限度，未知雜質(zhì)限度和單雜質(zhì)限度計算方法可采用對照品法加校正因子的自身對照法，不加校正因子的自身對照法或根據(jù)不同雜質(zhì)采用不同方法。干燥失重與水分“干燥失重”系指在規(guī)定的條件下，測定藥物中所含能被驅(qū)去的水或其他揮發(fā)性物質(zhì)。水分系指用費休氏法或甲苯法測得藥品中的殘留水和結(jié)晶水的總和，但不包括其他揮發(fā)性物質(zhì)，為了真實反映含量，一般均應(yīng)加以規(guī)定，尤其是對具有吸濕性或含有結(jié)晶水，以及因含水量高將影響其穩(wěn)定性的藥品，更應(yīng)訂入質(zhì)量標準中。含結(jié)晶水的，并因風(fēng)化失水過多時將影響用藥劑量的藥物，應(yīng)制訂高低范圍。遇熱易變色破壞或分解的藥品宜采用費休氏水分測定法或減壓干燥法測定。熾灼殘渣系指硫酸化灰分，以轉(zhuǎn)化成硫酸鹽的重量計算，用以考查有機藥物中混入的各種無機雜質(zhì)，是控制無機雜質(zhì)的一種簡便方法；因取樣量大，對用藥劑量小而又價格昂貴的藥品，一般可不訂入質(zhì)量標準，但應(yīng)提供研究的數(shù)據(jù)。金屬離子和重金屬藥物中對某單一金屬離子的檢查，不同于重金屬檢查，是有其針對性的，如鋇鹽對人體有毒，鐵鹽能加速藥物的氧化、降解；因此根據(jù)所用原料和生產(chǎn)工藝，制訂檢查的內(nèi)容和要求。檢測方法一般可采用原子吸收分光光度法（如鉀、鈉、鈣、鋅）、比濁法或比色法（如銅、鎳、鉛等）。重金屬系指在規(guī)定的實驗條件下，能與硫代乙酰胺試液或硫化鈉作用顯色的雜質(zhì)，用以檢查藥物是否污染上金屬離子；要作本項檢查的除有特殊要求外， 或以上，并長期給藥的品種，不要作為對藥品質(zhì)量的普遍要求。一般有四種測定方法：第一法為最常用的方法，一般用于水溶性藥物；在水中不溶的可改用乙醇。第二法適用于不溶于水或乙醇的藥物，或因自身有顏色，可取熾灼殘渣項下遺留的殘渣進行檢查。第三法是在堿性條件下，用硫化鈉試液作為顯色劑的檢查方法，主要用于溶解于堿而不溶于酸的有機藥物的檢查。第四法為微孔薄膜法，可避免供試品原有顏色的干擾，靈敏度高， – 5ug 的梯度明顯，取用量中的pb宜在2 – 4ug，可推廣應(yīng)用。硒或砷鹽硒和砷均為毒性雜質(zhì)，可按中國藥典現(xiàn)行版附錄規(guī)定的方法，進行檢測。硒一般需采用氧瓶燃燒法進行有機破壞后，用分光光度法，與對照品溶液對照進行檢測。砷鹽有二種測定法，第一法為古蔡氏法。對于具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機藥物，因砷有可能以其價鍵結(jié)合在雜環(huán)分子中，需經(jīng)有機破壞后檢查，第二法為二乙基二硫代氨基甲酸銀比色法，不僅咳用于限度檢查，也可用作微量砷鹽測定。對于一些外用藥或藥量較少的口服藥，可少用此項檢查。1安全性試驗藥品中存在的某些痕量雜質(zhì)，可對人體產(chǎn)生特殊的生理作用，抗生素藥品或供注射用原料藥，必要性應(yīng)檢查異常毒性、熱原或細菌內(nèi)毒素、過敏性雜質(zhì)、降壓物質(zhì)與無菌等項。綜上所述，藥品純度檢驗，包括的內(nèi)容眾多，在進行藥品質(zhì)量研究時可根據(jù)研制藥物的性質(zhì)及要求，進行擇要的考察。除用文字記述外，也可列表說明，如表表表6。表4 檢查項目測定數(shù)據(jù) 批號 020115 020116 020117 020118項目溶液澄清度 澄清 相當于1號 相當于2號 相當于1號 標準比濁液 標準比濁液 標準比濁液酸度 氯化物 100ppm 120ppm 80ppm 50ppm熾灼殘渣 % % % %吡啶 100ppm 50ppm 80ppm 60ppm干燥失重 % % % %有關(guān)物質(zhì) % % % %(HPLC)（一）化學(xué)藥物雜質(zhì)研究 任何影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)。雜質(zhì)的研究是藥品研發(fā)的一項重要內(nèi)容。應(yīng)參照《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》。本項研究包括選擇合適的分析方法準確地分辨與測定雜質(zhì)的含量并綜合藥學(xué)、毒理及臨床研究的結(jié)果確定雜質(zhì)的合理限度。這一研究貫穿于藥品研發(fā)的整個過程。 由于藥品在臨床使用中產(chǎn)生的不良反應(yīng)除了與藥品本身的藥理活性有關(guān)外，有時與藥品中存在的雜質(zhì)也有很大關(guān)系。例如，青霉素等抗生素中的多聚物等高分子雜質(zhì)是引起過敏的主要原因。所以規(guī)范地進行雜質(zhì)的研究，并將其控制在一個安全合理的限度范圍之內(nèi)，將直接關(guān)系到上市藥品的質(zhì)量及安全性。 由于此項研究探索性很強，希研究單位在科學(xué)合理的基礎(chǔ)上對雜質(zhì)進行研究，用科學(xué)實測數(shù)據(jù)證明藥品中存在的雜質(zhì)可被控制在安全、合理的范圍內(nèi)就達到了雜質(zhì)研究的目的。1．雜質(zhì)的分類毒性雜質(zhì)（具強烈不良生物作用）普通雜質(zhì)（在存在量下無顯著不良生物作用）毒性其他甾體，其他生物堿、幾何異構(gòu)體、聚合物結(jié)構(gòu)有關(guān)物質(zhì)（包括化學(xué)反應(yīng)的前體，中間體，付產(chǎn)物，降解產(chǎn)物等）其他雜質(zhì)，外來物質(zhì)來源有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)、有機揮發(fā)性雜質(zhì)化學(xué)類別和特性分類依據(jù) 一般主要按照雜質(zhì)的理化性質(zhì)分類： 有機雜質(zhì)包括工藝中引入的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物等，由于這類雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)一般與活性成份類似或具有淵源關(guān)系，通常又可稱之為有關(guān)物質(zhì)。 無機雜質(zhì)通常是已知的，主要包括：反應(yīng)試劑、配位體、催化劑、重金屬、其他殘留的金屬、無機鹽、活性炭等。 殘留溶劑是指在原料藥、輔料及制劑生產(chǎn)過程中使用的有機溶劑。其研究應(yīng)參照《有機溶劑殘留量研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》和“殘留溶劑測定法”（中國藥典2005年版附錄ⅧP）。2．有機雜質(zhì)的檢測方法包括化學(xué)法、光譜法、色譜法等，因藥物結(jié)構(gòu)及降解產(chǎn)物的不同采用不同的檢測方法。通過合適的分析技術(shù)將不同結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)進行分離、檢測，從而達到對雜質(zhì)的有效控制。目前普遍采用的雜質(zhì)檢測方法主要為高效液相色譜、薄層色譜法、氣相色譜法和毛細管電泳法。 應(yīng)根據(jù)藥物及雜質(zhì)的理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、雜質(zhì)的控制要求等確定適宜的檢測方法。由于各種分析方法均具有一定的局限性，因此在進行雜質(zhì)分析時，應(yīng)注意不同原理的分析方法間的相互補充與驗證。 3．雜質(zhì)檢測方法的驗證重點在于專屬性和靈敏度的驗證。 專屬性系指在其他成份可能共存的情況下，采用的方法能準確測出被測雜質(zhì)的特性。 檢測限是反映分析方法靈敏度的一個重要指標，系指分析方法能檢測藥品中被測雜質(zhì)的最低濃度，但不必定量。 對于原料藥，可根據(jù)其合成工藝，采用各步反應(yīng)的中間體（尤其是后幾步反應(yīng)的中間體）、立體異構(gòu)體、粗品、重結(jié)晶母液等作為測試品進行系統(tǒng)適用性研究，考察產(chǎn)品中各雜質(zhì)峰及主成分峰間的分離度是否符合要求，從而驗證方法對工藝雜質(zhì)的分離能力。 為了考察方法能否有效檢測出原料藥或制劑中的降解產(chǎn)物，可根據(jù)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點、制劑的處方與工藝，貯存條件等選用合適的酸、堿、光、熱氧化反應(yīng)等加速破壞性試驗來驗證分析方法的專屬性，必要時可采用二極管陣列檢測器、質(zhì)譜檢測器等檢測峰的純度。 強制降解試驗對于未知雜質(zhì)的分離度考察是非常必要的，其目的主要是提供關(guān)于雜質(zhì)（特別是降解物）與主成分的分離情況、樣品穩(wěn)定性及降解途徑等重要信息。破壞試驗的程度暫無統(tǒng)一要求，一般以強力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜。此時已產(chǎn)生了一定量的降解產(chǎn)物，與樣品長期放置的降解情況相似，考察此情況下的分離度更具有實際意義。 4．有機雜質(zhì)的定量方法： 有機雜質(zhì)的檢測方法一般多采用HPLC法，有時也采用TLC、GC等其他方法。 如采用HPLC法，須采用峰面積，具體定量方法有①外標法（雜質(zhì)對照品法）；②加校正因子的主成份自身對照法；③不加校正因子的主成份自身對照法；④峰面積歸一化法。 ①法定量比較準確，采用時應(yīng)對對照品進行評估和確認，并制訂質(zhì)量要求。②法應(yīng)對校正因子進行嚴格測定，僅適用于已知雜質(zhì)的控制。③法的前提是假定雜質(zhì)與主成分的響應(yīng)因子基本相同（雜質(zhì)對主成份的相對晌應(yīng)因子在0．9—1．1范圍內(nèi)）。 ④法簡便快捷，但因各雜質(zhì)與主成分響應(yīng)因子不一定相同、雜質(zhì)量與主成分量不一定在同一線性范圍內(nèi)、儀器對微量雜質(zhì)和常量主成分和積分精度及準確度不相同等因素，所以在質(zhì)量標準中采用有一定的局限性。 5．雜質(zhì)檢測數(shù)據(jù)的積累 雜質(zhì)檢測數(shù)據(jù)的積累是制訂質(zhì)量標準中雜質(zhì)限度的重要依據(jù)之一，它包括藥品研制過程中所有批次樣品（包括用于安全性、臨床研究的樣品）的雜質(zhì)檢測數(shù)據(jù)。 檢測結(jié)果應(yīng)提供具體數(shù)據(jù)（如雜質(zhì)的保留時間及含量），不能籠統(tǒng)地表述為“符合要求”或合格等。建議用表格的形式，列出產(chǎn)品批號、生產(chǎn)日期、單個雜質(zhì)及總雜質(zhì)的含量并應(yīng)提供色譜圖。馬來酸羅格列酮有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果1．10．950．931．10．98總雜質(zhì)（%）0．350．380．320．300．30雜質(zhì)Ⅱ（%）0．460．560．500．540．52雜質(zhì)Ⅰ（%）（未還原物）7．387．407．367．387．397．482．802．792．752．782．812．65保留時間（分）羅格列酮馬來酸080228080218080211080202080107批號 方法學(xué)研究中雜質(zhì)分離度和檢測限的圖譜、代表性批次的圖譜、采用其它雜質(zhì)檢測方法所得的圖譜、加速及長期穩(wěn)定性試驗的圖譜等，可以輔助說明產(chǎn)品中雜質(zhì)的概況。表5 異構(gòu)體分離的色譜條件篩選 因素 色譜柱 流動項 柱溫 結(jié) 果圖號1A 手性色譜柱 乙腈一水 室溫 拖尾因子 (55:45) , 2A 手性色譜柱 乙腈一水 15℃ 拖尾因子 (60:40) , 3A 手性色譜柱 乙腈一水 30℃ 拖尾因子 (60:40) , 表6 降解破壞性試驗測定結(jié)果 條件 降解方法 結(jié) 果圖號1A 取供試品溶液2ml,加2%氫氧化鈉 主峰與3個雜質(zhì)峰分離 溶液10ml,室溫放置10小時2A 取供試品溶液2ml,加1%鹽酸 主峰與所有雜質(zhì)峰分離 溶液10ml,室溫放置6小時3A 取供試品溶液