【文章內容簡介】 疫苗中組分間的相互作用所致，并證明降低的效價不會導致人群免疫后低的免疫應答。如果已經證明后序的生產工藝對原液的效價沒有影響時，可以用對原液的效價測定代替對成品的效價測定，但凍干制品必需對成品進行效價測定。對含有佐劑的疫苗，抗原的吸附度對制品的效價會產生較大的 影響，因此應測定成品的效力。效力試驗應能證實組分間的相互作用使某一種組分對其他組分產生增強或減弱作用。效力試驗可以用動物免疫原性試驗，對每一種抗原的免疫應答以及應答的質量都應進行研究，這些研究應當包括測定抗體的分類、親和力、親和性、抗體動態(tài)變化或功能，例如測定中和靶抗原或毒素的能力。最好是用動物試驗比較聯合疫苗與單個抗原的免疫應答情況，以確定是否發(fā)生了免疫應答的增強或抑制現象。同樣，也應在動物免疫原性研究中測定活疫苗株之間的免疫干擾現象。 對于一個新的疫苗或者聯合疫苗中含有人體未曾使用過的新抗原，只要有 動物模型，就應當首先用動物模型對其保護力進行研究。保護力試驗應當采用擬預防疾病的有毒株來攻擊。應當按照經統計學和經科學驗證的試驗步驟對試驗結果進行確認，并應詳細描述。此項試驗應在產品的開發(fā)早期進行。 （三）鑒別試驗 應對聯合疫苗中每一活性組分進行檢定，目的是證明制品的內容物與其標簽的標示相一致。 （四）無菌檢查 聯合疫苗中的各組份以及成品疫苗均應符合無菌試驗的要求。對含有殘余抗生素、含有未曾使用過的防腐劑或含有顆粒狀佐劑的制品，對其半成品和成品的無菌試驗應進行研究，并建立適宜于這些制品的無菌 試驗方法。 （五）純度試驗 聯合疫苗中每一種組分均應達到該組分的純度要求，如 Hib－ DTP 偶聯疫苗中的 Hib 組分，即使與已知含有內毒素的 DTP 配制成聯合疫苗，也應當符合 Hib 制品熱原試驗的要求。在此種情況下則不要求對成品進行熱原檢查。此外，對組分進行純度測定用的 SDSPAGE檢測，也不適用于成品。 四、聯合疫苗臨床研究中應注意的問題 聯合疫苗的臨床研究與其他疫苗一樣首先應遵循《藥品臨床試驗管理規(guī)范》（ GCP）的要求。由于聯合疫苗是多組分的，在臨床研究中對于安全性和有效性的研究與單一成分的疫苗有所不同，應注意以下幾方面的問題。 （一）安全性研究 一般來講，聯合疫苗的安全性研究是與同時在不同部位接種聯合疫苗中的每一種單價組分疫苗進行比較，例如，接種 DTPHB 疫苗與分別接種 DTP 和 HB 疫苗進行比較。臨床試驗應是隨機的，且應設對照組，如分別在不同部位同時注射聯合疫苗中所含有的單價組份疫苗的對照。 臨床試驗中應觀察接種后的不良反應，還應進行跟蹤研究，應在臨床研究開始前確定不良反應的判定標準和跟蹤研究方案。一般滅活疫苗應進行 7 天的主動監(jiān)測，活疫苗應進行 14 天以上的主動監(jiān)測，還應進行 30 天 電話隨訪或采用調查表的方式。觀察的不良反應包括全身反應如：發(fā)熱、不適、頭疼、嘔吐、哭鬧，及紅斑、硬結、疼痛、 觸痛等局部反應；以及不常見或罕見的不良反應。 （二）免疫原性研究 應當對聯合疫苗中所有組分的免疫原性進行研究。應當將聯合疫苗的免疫原性與分別同時接種在不同部位的各單價組分疫苗的免疫原性進行比較，如果聯合疫苗中的某些組分是已獲生產文號的，那么，該已獲得文號的單組份疫苗可以用于免疫原性研究的對照組。聯合疫苗中的每一種血清型或組分在聯合疫苗中均應有相應的免疫原性要求。在臨床試驗方案中應包含各組分免 疫原性與其保護性之間關系研究的要求。 評價每一組分的免疫原性的參數是非常關鍵的，應廣泛征求有關專家的意見，確定評價疫苗免疫原性的參數以及各參數的合格標準。一般來講，抗體水平和血清陽轉對于臨床保護性只起一定的參考作用。應當注重抗體的質量而不是僅僅是抗體的量，例如，抗體的親和性、功能、抗原決定族的識別位點以及其他規(guī)定的參數對確定應答抗體的質量是非常重要的。 免疫原性比較研究的目的旨在證明聯合疫苗接種后各組份疫苗的免疫應答與同時分別接種聯合疫苗中的各單組份疫苗后的免疫應答之間是否有顯著區(qū)別。研究的設計應能 證明聯合疫苗與原單價疫苗的免疫原性相一致，應能證明和排除在臨床上抗體幾何平均滴度（ GMTs）和 /或者血清陽轉率方面的顯著性差別，同時應考慮測定方法和受試者的內在變化的影響。臨床試驗方案中應對聯合疫苗接種后各單組份疫苗的免疫應答與直接接種單組份疫苗的免疫應答可能存在的顯著差別作出明確的定義，在試驗假設中應清楚地表明哪些差別是將被排除的，并且以此來計算出受試人群的大小。應當對任何觀測到的差別評價其臨床相關性，對每一個組分在免疫劑量或免疫程序上的改變，均應有臨床數據作為其改變的依據。 用于臨床驗證的制品批數可 以比用于生產一致性研究的批數少。但是，在某些情況下，例如制品中含有未獲生產文號的組分時，臨床驗證時應使用更多的批數，應至少有一批是用于生產一致性研究的制品，并且，應采用制備聯合疫苗的同批單價疫苗進行接種的對照組試驗，以避免由于批間的不同而引起免疫原性的不同。對所使用的疫苗批間的差異要進行分析。因此，臨床試驗也應考慮以上因素對臨床研究結果的影響。 （三）有效性研究 每一組分的有效性均應經過臨床試驗得到證明。比較理想的臨床試驗是前瞻性的、隨機的和有對照的。評價有效性所使用的判定終點，一般是疾病的發(fā)病率， 但也可以是已經確定了的 “保護性相關指標 ”。疫苗有效性試驗中所使用的保護性相關指標，應為經過充分驗證的和臨床試驗證明的可以保護該疾病的實驗室參數。如果一個免疫學的保護性相關指標在能夠確定質和量的相互關系時，就可以代替流行病學指標。具有一定滴度的某些類別的抗體與保護性具有相關性，例如免疫后破傷風抗毒素的中和抗體單位大于 ，則認為可保護受試者免于破傷風的發(fā)生。 如果聯合疫苗中的單組分疫苗的保護性效力是經過證實的，這一研究結果可以作為參考資料來支持聯合疫苗的研發(fā)。在臨床試驗時，可采用與單價組份 疫苗的橋接試驗來比較聯合疫苗中這組份疫苗的保護性效力。 如果聯合疫苗免疫后產生的抗體水平低于單價組分疫苗，但仍能達到保護性作用的，應提供相應的數據或資料證明其保護的有效性及持久性。 在評價制品有效性時，一般不選用病例對照試驗（ casecontrol）。由于該試驗在許多方面有可能產生偏差，因此，在采用該方法時，應在試驗方案中詳盡地闡述如何降低偏差和采取的糾正措施。 一般來說，測定多價血清型的聯合疫苗中每一個血清型的效力是比較困難的。因此可采用相應的替代方案。應當根據目標人群中相應血清型疾病的發(fā)病 率設計此類疫苗有效性的臨床試驗。如果臨床試驗的判定終點是以該疫苗所預防的各型疾病發(fā)病率的總和時，該試驗應當具有相當的規(guī)模，即確保發(fā)病率低的血清型仍能有一定數量人群的數據，以評價其有效性。 對于多價血清型的聯合疫苗，由于缺乏足夠數量的病例而不能夠進行臨床有效性的評價時，在某些情況下，可以用免疫原性的數據推斷其有效性。如果在臨床上已經證明了血清學和有效性存在著相關關系時，可以使用免疫原性數據推斷其有效性。 （四）數據統計 臨床研究中很重要的一個問題是確定受試人群的大小?，F在尚無計算聯合疫苗臨床試驗受 試人群大小的標準，評價主要基于統計學、臨床學和基礎科學的評價結果。 多數聯合疫苗的臨床試驗均以在不同部位分別接種各組分疫苗或接種各組份混合后疫苗為試驗的對照組，受試者應當隨機地分配到各疫苗組。按照受試者的特性（如：年齡或者到達試驗點的日期）分組的方法不符合隨機分配的原則。 為了證明聯合疫苗與單價疫苗等效性的臨床試驗，應當設計一個拒絕有區(qū)別的假設試驗，而不是傳統意義上的無區(qū)別的 “無效 ”假設試驗。為了證明發(fā)生率和比例相同或等價時，采用單側檢驗是適宜的，因臨床試驗的目的在于證明注射聯合疫苗與分別注射的單價 組分疫苗無明顯差異。 如果要證明聯合疫苗優(yōu)于分別注射的單價組分疫苗，應當設計一個檢驗差異的臨床試驗，而不是一個檢驗等價的試驗。 對于免疫應答，一般分析接種后的 GMT 或 GMR（應答率的幾何均值），通常是為了排除聯合疫苗和分別注射的單價組分疫苗間在臨床上有意義的差別。對于要排除事先規(guī)定的差別的臨床試驗規(guī)模，應計算考慮受試人群的大小。 如果聯合疫苗的免疫應答未顯示明顯地低于分別注射的單價疫苗，那么，可采用雙側的生物等價檢驗來分析 GMT。理想的設計是聯合疫苗誘導所產生的抗體滴度既不比預先規(guī)定的量太低也不 會太高。 臨床結果分析時，應同時進行血清的陽轉率與抗體滴度的分析比較研究。在沒有保護性替代指標的情況下，如果沒有陽轉率與 GMT 間的分析和評價是很難得出結論。如果已經建立了保護性免疫的替代指標，在評價聯合疫苗和分別注射的單價組分疫苗間的差別時，就應當考慮保護性免疫替代指標。 對于評價常見的不良反應，試驗組中聯 合疫苗為一個接種部位，而對照組為二個或多個接種部位，這種對比分析試驗不是雙盲的。因此，在分析時應將單部位接種的反應（聯合疫苗組）與多部位接種（對照組）當中反應最嚴重的一點進行比較。還應考慮到在個體內的不同組分間的相互作用。 對于不常見的不良反應的評價，臨床試驗中應根據疫苗目標人群的大小來確定受試人群的大小。 對于罕見的不良反應的評價，受試人群的規(guī)模應當足夠大，如果未觀察到不良反應，可認為在目標人群中發(fā)生的可能性也很低。 總之，聯合疫苗的研發(fā)和臨床試驗不同于一般疫苗，除一般要求以外，還應充分考慮多種組分聯合后產生的相互作用對聯合后疫苗的安全性和有效性的影響，以及是否產生毒性逆轉或重組。在臨床試驗時，應采用聯合疫苗中各組分分別但同時接種作為對照組，由于對照組是多部位接種，給不良反應的評價帶來了困難，同時還應充分考慮各組分在體內的相互作用而產生的影響。因此，不能簡單地采用一種固定的模式研究聯合疫苗的安全性和有效性。 多肽疫苗生產及質控技術指導原則 前 言 多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學合成技術制備的疫苗。傳統疫苗一 般由兩種方式制備，一種為能誘發(fā)免疫力卻不致病的減毒疫苗，例如黃熱病、脊髓灰質炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一種為滅活疫苗（例如百日咳桿菌、狂犬病毒、傷寒桿菌）。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或滅活不全的問題。特別是一些還不能通過體外培養(yǎng)方式獲得足夠量的抗原的微生物病原體。有些雖能進行體外培養(yǎng)，但這些病原體有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性的問題。多肽作為體內引起效應細胞免疫應答形成的免疫原，將成為一種新型的疫苗，但還有很多理論和技術問題要繼續(xù)研究，目前尚無多肽疫苗獲準上市。因此，應采取適當可 行的途徑對這種潛能疫苗進行生產及質控，并在其生產過程中積累經驗，為此，應加強咨詢和論證，以便提出一個確保安全有效而又適合實際的申報資料。同時，對每個方案中各個階段的操作過程、中間及最終產品的制備，務必制定標準操作規(guī)程和質控標準，并予嚴格實施。 一、多肽疫苗的化學合成 首先應該確定天然抗原的氨基酸序列，選擇和確定尋找有效肽段的方法，并尋找該肽段所針對的抗原決定簇。 其次應選擇合適的合成方法。合成中等大小的多肽也會涉及眾多反應，每加入一個氨基酸需多次反應，在一個氨基酸的 α 氨基與另一個氨基酸的羧基縮合 形成肽鏈之前，必須使其中一個形成高反應的活化狀態(tài)，這個選擇自然落到羧基上，合成因而從 C 到 N 端。如果 A氨基酸的 C 端與 B 氨基酸的 N 端縮合產生 2 肽 A－ B，則 A 的 N 端及 B 的 C 端必須保護起來，才能轉化成在 A－ B 之間形成特異性肽的形式。此外，氨基肽的側鏈基團也能與活化羧基反應，因此也必須保護起來。這些側鏈保護基團必須能耐受除去 α－氨基保護基團的條件，這樣才能生成新的氨基基團使肽鏈得以繼續(xù)延長。合成結束后必須除去所有的保護性基團以得到所需的多肽。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應，每一循環(huán)生成一個新肽鍵。 主要有兩個合 成策略：片段濃縮法和固相合成法（ merrifield 法）。片段濃縮法是經典的 合成技術。首先合成數條小肽，經純化和去保護后結合成較長的肽，直到最后所需的序列。 在固相合成法是將肽鏈一端結合于固相載體上的方法。通過在 N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。 另外也引入一些新進展包括改良的保護基因、新的固相載體、脫保護及側鏈功基保護等新方法。在疫苗合成領域中，由于肽鏈聯接或裝配到需要的結構（ TADPs）及免疫原性構架（ MAPs）所用技術的引進，加上肽鏈經脂質或碳水化合物的修飾作用，使得合成問題變得更加復雜 。目前多應用固相法，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑。 二、多肽疫苗的生產工藝及質控 （一）應提供研制某一疫苗的詳細資料，包括選擇特定抗原決定簇的理由、對抗原決定簇的檢定，以及對載體、表位連接、結合劑、肽的呈遞方式及佐劑等的選擇理由及其相應證據。 （二）應說明每條肽段所針對的抗原表位。內容包括對每個表位來源的說明，當不止一個表位時，應說明把不同表位相互結合到一個已知序列內的理由，此外還應對表位的類型（ B、 Th、 Tc 等）及特殊組合方式進行說明。 （三） 應當提供肽鏈合成的詳細資料。內容包括：原料的來源和特性、使用的方法學、氨基酸的連接和脫保護，進入下一步連接的判斷標準，任何加入的修飾基團（例如糖基化，脂質化）的詳細情況。如果采用了液體合成法，應當提供包括對中間體有特殊說明的流程圖。