【文章內(nèi)容簡介】 和后基因組研究 舉例： 美國斯坦福大學 Davis等用 PCR法從外周血淋巴細胞 cDNA文庫中得到了 1046種 cDNA片段 ， 制成芯片 ， 然后與熱處理的 T淋巴細胞和未處理的 T細胞種提取的 mRNA反轉(zhuǎn)錄出的單鏈 cDNA片段雜交 ， 經(jīng)激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析 ， 共發(fā)現(xiàn) 17個差異表達的基因 ， 其中 11個是被熱誘導的 ， 6個是被熱抑制的 。 經(jīng)序列分析證實 ， 其中 3個是未報導的新基因 。 第二節(jié) 蛋白質(zhì)分析技術(shù) ? 講述內(nèi)容： 一 、 Western Blot 二 、 ELISA 三 、 免疫熒光技術(shù) 四 、 免疫組織化學技術(shù) 五 、 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù) 一 Western Blot ? 1 原理 ： ? 將通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或 PVDF膜上，然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進行反應，洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后，加入標記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標記抗體，加入適合標記物的檢測試劑進行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)，也可通過條帶的密度大小來進行特異性蛋白的半定量。 2 操作過程 ? SDSPAGE電泳 轉(zhuǎn)膜（ PVDF或硝酸纖維素膜） ? 封閉 一抗 洗滌 酶標二抗反應 ? 洗滌 顯色或化學發(fā)光顯影 Hours 0 4 8 16 Western blot analysis of the cleavage of Caspase3. IM9/Bcl2 Cells were treated with 20?M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control 0h 4h 8h 16h Western Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypoltreated IM9/Bcl2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDSPAGE followed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. CytoC XProtein 3 注意的問題 ? （ 1） 蛋白質(zhì)電泳 ? 常用 SDSPAGE：單一亞基組成的蛋白質(zhì) ? 非變性 PAGE：多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) ? TrisTricine膠中電泳：用于分子量小于 10kDa的多肽和蛋白的電泳，能夠獲得較好的分離效果。 聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性，操作時要戴手套 （ 2）轉(zhuǎn)膜 ? 戴手套，避免用手接觸濾紙、凝膠和膜，因為手上的油脂會阻斷轉(zhuǎn)印。 濾紙和膜的尺寸與凝膠大小一致 ? 以適量的轉(zhuǎn)移 Buffer室溫平衡濾紙、凝膠和膜 15－ 30min，如果是 PVDF膜，必須先用甲醇激活后浸泡。 ? 方向正確：凝膠在陰極，膜在陽極 ? 排去濾紙、膠和膜間的氣泡。 ? 電轉(zhuǎn)時間： 100V 12h,可根據(jù)蛋白分子量的大小靈活 選擇 ? 轉(zhuǎn)移結(jié)束后，凝膠用考馬氏亮蘭染色以確定轉(zhuǎn)移效率 ? 膜用麗春紅染色觀察蛋白分子量標準的位置 （ 3）封閉 ? 用 5％脫脂奶粉或 3％ BSA ? （含 ％ Tween20 TBS或 PBS配制） ? 時間：室溫 2h或 4186。C過夜 （ 4）顯色或顯影 ? 顯色 ? 辣根過氧化物酶：底物為 DAB ? 堿性磷酸酶：底物為 BCIP/NBT ? 化學發(fā)光顯影 ? 最常用。辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶有不同的發(fā)光底物（商品化產(chǎn)品） ? 注意：化學發(fā)光前將膜用不含 Tween20的 TBS或 PBS洗滌一次 ? 曝光的時間和顯影的時間根據(jù)實際情況而定 （ 5）膜的再利用 ? 化學發(fā)光后的硝酸纖維素膜用 Stripping Buffer洗滌后（洗滌 Buffer: 的 TrisHCI含 2％ SDS和100mm的 ? － 2ME ） 用不同的一抗進行雜交，檢測其它蛋白的表達情況。一張膜可以重復使用 3－ 4次。 ? 堿性磷酸酶顯色的膜不能再進行雜交 ? 1 原理： ? ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。測定方法具有很高的敏感度（ pgng/ml水平），并且重復性好。 二、 ELISA ELISA 常用的酶和底物 ? 辣根過氧化物酶，底物為 OPD, 深桔黃色 ，檢測波長 492nm ? TMB， 藍綠色，檢測波長 450nm 堿性磷酸酶，底物為 PNPP（對－消基苯磷酸酯） , 黃色 檢測波長 405nm ELISA各步驟的反應時間 包被： 24－ 36h，蛋白濃度為 1－ 5ug/ml 封閉： 37186。C 2h 或 4186。C過夜（ 3％ BSA） 樣本反應時間： 37186。C 45min1h 酶標抗體反應時間： 37186。C 45min1h 顯色時間： 15min(避光） 設對照 可以一次包被多塊板，凍存?zhèn)溆? 2 類型 （ 1）間接法測抗體 間接法是檢測抗體常用的方法 。其原理為利用酶標記的抗 抗 體，檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。 常用于臨床血清中 自身抗體 的檢測，以及 雜交瘤上清 特異性 抗體的篩選。如血清中 PDCD5自身抗體的檢測。 方法： 抗原包被 封閉 待檢抗體 洗滌 酶標二抗 洗滌 顯色反應 終止反應 ELISA Reader檢測 OD值 (2) 雙抗體夾心法測抗原 ? 是檢測抗原最常用的方法。 只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 常用的組合： 單克隆抗體＋多克隆抗體 單克隆抗體＋單克隆抗體 后一組合是兩種單克隆抗體針對抗原上不同的相距較遠的兩個抗原決定簇，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。 用途：測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用 于測定半抗