【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 現(xiàn) RNaseP的蛋白部分不具催化功能 ， 而 RNA部分 在有足夠濃度Mg2+存在下 ， 能起 核酸水解酶 的作用 。 ? 證明了核酸既是信息分子 ， 又是功能分子 。 核酶的催化性質(zhì) ? RNA作用于 RNA； ? 核酸酶催化的反應(yīng)主要包括 :水解反應(yīng)(RNA限制性內(nèi)切酶活性 )， 連接反應(yīng) (聚合酶活性 )和 轉(zhuǎn)核苷酰反應(yīng) 等； ? 最近核酸酶的其他作用底物也已被發(fā)現(xiàn)，如 多糖、 DNA以及氨基酸酯等 。 核酶研究中的兩個(gè)問題 ? 核酶催化效率太低 。 ? 由于核酶本身是 RNA， 很容易被核酸水解酶 (RNase)所破壞 。 因此，要將核酶應(yīng)用于體內(nèi)阻斷基因表達(dá)或作為抗病毒的臨床藥物，還要做大量的研究工作。 三、酶的作用機(jī)制 降低化學(xué)反應(yīng)所需的活化能 （ 1）中間產(chǎn)物學(xué)說： 學(xué)說認(rèn)為： 當(dāng)酶催化一化學(xué)反應(yīng)時(shí)，首先 E和 S結(jié)合形成中間產(chǎn)物 ES，然后它再分解成產(chǎn)物 P并釋放酶 E。 ES E + S E + P k1 k2 k3 中間產(chǎn)物學(xué)說 1）中間產(chǎn)物比底物需較少的活化能就可分解成產(chǎn)物并放出酶。 2） [ES] 決定酶促反應(yīng)速度。 3）中間產(chǎn)物形成的 實(shí)驗(yàn)依據(jù) ： 同位素 32P標(biāo)記底物法（磷酸化酶與葡萄糖結(jié)合） 吸收光譜法（過氧化物酶與過氧化氫結(jié)合） （ 2）決定酶作用專一性的機(jī)制 鎖鑰學(xué)說 ： 1894年 提出： S分子或其一部分像鑰匙一樣楔入 E活性中心部位。 此學(xué)說強(qiáng)調(diào) E與 S結(jié)構(gòu)互相吻合 (剛性模板 )。 物理吸附 誘導(dǎo)契合學(xué)說 1958年 Koshland 提出： 當(dāng) E與 S接近時(shí)， E蛋白受 S分子的誘 導(dǎo)，其構(gòu)象發(fā)生有 利于 S結(jié)合的變化， E與 S在此基礎(chǔ)上互 補(bǔ)契合、進(jìn)行反應(yīng)。 誘導(dǎo)契合假說 （ 3）使酶具高催化效率的因素： １）酶與底物的 “ 鄰近 ” 及 “ 定向 ” 效應(yīng) ? 鄰近 (proximity)： 在酶促反應(yīng)中，底物分子 →酶的活性中心 → 酶活性中心的有效濃度大大增加 → 提高反應(yīng)速度。 ? 定向 (orientation):底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)與酶活性中心的相關(guān)基團(tuán)相互接近，并正確定向 → 高效率和專一性特點(diǎn)。 ? 分子間反應(yīng)變?yōu)榉肿觾?nèi)反應(yīng)。 2）“張力”和“形變” ? X衍射證實(shí)： E使 S分子中敏感鍵中某些基團(tuán)的電子密度變化，產(chǎn)生電子張力 ，使其發(fā)生變形，更易于斷裂。 A： S變形 B： S和 E都變形 3）酸堿催化 指 E分子上某 些基團(tuán)作為質(zhì) 子供體和質(zhì)子 受體對(duì) S進(jìn)行 （廣義的）酸 堿催化。 廣義酸－堿催化是指 通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子 ,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過程。 4）共價(jià)催化 E分子中的親核基團(tuán)提供電子，對(duì) S中親電子的碳原子進(jìn)行攻擊， 生成 ES使反應(yīng)活化能降低， S可越過較低的能壘而形成產(chǎn)物。 使酶具高催化效率的因素： １）酶與底物的 “ 鄰近 ” 及 “ 定向 ” 效應(yīng) 2）“張力”和“形變” 3）酸堿催化 4）共價(jià)催化 ?酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 研究各種因素對(duì) 酶促反應(yīng)速度 的影響。 ?影響因素包括有 底物濃度、酶濃度、溫度、 pH、 抑制劑、激活劑。 四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) I. 單底物 、 單產(chǎn)物反應(yīng) 。 II. 酶促反應(yīng)速度 用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來(lái)表示 。 研究前提 1. 底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響 矩形雙曲線 ※ 1913 年 Michaelis 和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式 ， 即 米－曼氏方程式 ， 簡(jiǎn)稱米氏方程式(Michaelis equation)。 Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ 1）米氏方程的推導(dǎo) 根據(jù)中間產(chǎn)物學(xué)說： 式中 K1,K2,K3分別為各反應(yīng)常數(shù)，可知： ES形成速度 = K1 [E][S] ES分解速度 =(K2 + K3 )[ES] 當(dāng)反應(yīng)達(dá)恒穩(wěn)態(tài)時(shí) ,二速度相等 ,即 : K1 [E] [S] =(K2 + K3 ) [ES] S + E→ ES → E + P K1 K2 K3 ① 整理并令： 由于 [E] 與 [ES]之和為總的酶濃度 [Et] ,即 : [Et]= [E] + [ES] [E] = [Et][ES] 將③代入② : [ES] K1 = = [E] [S] (K2 + K3 ) Km ② ③ [ES] = ([Et][ES]) [S] Km 整理得 : ∵ 酶促反應(yīng)速度由 [ES]決定 ,而 υ= K3 [ES] ∴ [ES]= 將⑤代入④整理得 : [ES]= [Et] ． [S] Km + [S] ④ υ K3 ⑤ = [Et] ． [S] Km + [S] υ K3 ． ⑥ 此時(shí)達(dá)到最大反應(yīng)速度 Vmax: Vmax= K3 [Et] ⑦ 將⑦代入⑥ ,得米氏方程 : 當(dāng) [S] 升高 ,所有 E為 S所飽和時(shí) ,即 : [Et] =[ES] Ｖ Vmax[S] Km + [S] ＝ 當(dāng) v=Vmax/2時(shí) Km＝ [S] （ 1） Km值等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度， 單位是 mol/L。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 2） Km與 Vmax的意義 （ 2） Km是酶的特征性物理常數(shù)。 只與 E性質(zhì)有關(guān)，與 [E]無(wú)關(guān)； （ 3） 同一 E有幾個(gè) S就有幾個(gè) Km ， Km最小的為最適 S或天然 S。 （ 5） Vmax 定義 ： Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。 意義 ： Vmax=K3 [E] 如果酶的總濃度已知，可從 Vmax計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù) (turnover number)，即動(dòng)力學(xué)常數(shù)K3。 定義 — 當(dāng) 酶被底物充分飽和 時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。 意義 — 可用來(lái)比較每單位酶的催化能力。 酶的轉(zhuǎn)換數(shù) 3）Ｋ m值與Ｖ max值的測(cè)定 ① 雙倒數(shù)作圖法 (double reciprocal plot)，又稱為 林 貝氏 (Lineweaver Burk)作圖法 Vmax[S] Km+[S] V = （林－貝氏方程） 兩邊同取倒數(shù) V m a xv1 = K m . 1[ S ] + V m a x1 雙倒數(shù)作圖法 ② Hanes作圖法 斜率 = 1/Vm Km/Vm Km [S]/V [S] 在林 貝方程的基礎(chǔ)上，兩邊同乘 [S]