酶聯(lián)免疫分析技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-01 20:20 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程， 因 此 需經(jīng) 擴散 才能 達 到反 應(yīng)的 終點 。這 就 是為 什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。 溫育 ? 溫育所需時間與溫度成反比，即溫育溫度高，則所 需時間相對較短。 ? “邊緣效應(yīng) ” 的排除 : 使用水浴或在將反應(yīng)溶液加 入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如 37℃ ），就可以很容易地排除 “ 邊緣效應(yīng) ” ，并且 可提高測定的重復性。 ? 保溫 溫 育 常 采 用 的 溫 度 有 43 ℃ 、 37℃ 、 室 溫 和 4℃ （冰箱溫度）等。 37℃ 是實驗室中常用的保溫溫度， 也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。 保溫的方式一般均采用水浴，可將 ELISA 板置于 水 浴 箱中 ， ELISA 板 底 應(yīng)貼 著水 面， 使溫 度 迅速 平衡 。 為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋。 另外保溫的方式還有 ELISA儀器附有特制的電熱塊 反 應(yīng) 板 均 不 宜 疊 放 ， 以 保 證 各板 的 溫度 都 能 迅 速平衡。 室 溫 溫 育 的 反 應(yīng) ， 操 作 時 的 室溫 應(yīng) 嚴格 限 制 在 規(guī) 定 的 范圍 內(nèi) ， 標準 室 溫溫 度 是指 2025℃ ， 應(yīng)注 意 溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準確。為保證這一點， 一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。 加樣 ELISA中一般有 3次加樣步聚：即加標本，加酶 結(jié)合物，加底物。 ? 加樣時應(yīng)將所加物加在 ELISA板孔的底部，避免加在孔 壁上部，并注 ? 意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。 加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應(yīng)更 ? ? 換 吸 頭 ， 以 免 發(fā) 生 交 叉 污 染 。 然 后 在 微 型 震 蕩 器 上 震 蕩 1分 鐘 以 保 證 充分混和。 加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器 ，使加液過程 迅速完成。 從滴瓶中滴加試劑，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴 加太快，很容易出現(xiàn)重復滴加或加在兩孔之間的現(xiàn)象，這樣就會在孔 內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。 ? 洗滌 洗滌在 ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也 決定著 實驗的成敗 。 ELSIA洗滌：達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的。 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的 干擾物質(zhì)。 可以說在 ELISA操作中，洗滌是 最主要的關(guān)鍵技術(shù) 。 洗滌的方式：自動洗滌儀 手工操作 全自動加樣系統(tǒng)的標本 “ 交叉污染 ” 問題 洗板 ? ? ? ? 每次溫育后洗板是否徹底，與非特異背景顯色有很大關(guān) 系。 洗板液一般為含 % Tween20的中性 PBS。 Tween20 為 一 種 非 離 子 去 垢 劑 ， 既 含 親 水 基 團 ， 也 含 疏 水基團。 洗滌作用機理，借助其疏水基團與固相上蛋白的疏水基 團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其 親水基團與液相中水分子的結(jié)合作用下 ，促使蛋白質(zhì)脫 離固相而進入液相 ? 洗 板 液 中 Tween20 濃 度 高 于 % ， 可 使 包 被 于 固 相 上 的 抗原或抗體解吸附而影響試驗測定下限。 2022813 8 顯色 顯色是 ELISA中的最后一步溫 育反應(yīng)，此時酶催 化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的 溫度和時間 仍是 影響顯色的因素。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色， 而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。 注意： OPD底物顯色一般在 37℃ 反應(yīng) 2030分鐘 后即不再加深，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高。 OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行， 顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng) .OPD產(chǎn)物用硫酸 終止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。 顯 色 ? 加入底物 A和 B后，應(yīng)振蕩混勻 ? ? 當?shù)孜餅? OPD時，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行 一般商品試劑盒顯色反應(yīng)條件為 37 ℃ 或室溫 反應(yīng) 15～ 30 min。從理論上說， 37 ℃ 30分鐘 才可以使 HRP的底物催化反應(yīng)完全，盡管在最 初的 10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反應(yīng)即可完成。 因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色， 建議在 37℃ 下反應(yīng) 25～ 30分鐘后，終止反應(yīng) 比色測定。 顯色 TMB 受光照的影響不大，可在室溫中置于操 作 臺 上 ， 邊 反應(yīng) 觀 察 結(jié)果 。 但 為保 證 實 驗 結(jié) 果 的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結(jié)果。 TMB 經(jīng) HRP 作 用 后 ， 約 40 分 鐘 顯 色達 頂 峰 ， 隨即逐漸減弱，至 2 小時后即可完全消退至無色。 TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉 （ SDS ）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止能使藍色維 持較長時間。 此 外 ， 各 類酸 性 終 止液 則 會 使藍色 轉(zhuǎn) 變 成 黃色，此時可用特定的波
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