【文章內(nèi)容簡介】 用前不超過 30分鐘內(nèi)配制 ，充分混勻，至溶液呈亮綠色，最終 。 ３、操作步驟 (1) 新鮮組織恒冷箱切片； (2)冷丙酮或 10%福爾馬林固定 2025min； (3)蒸餾水洗； (4)入孵育液 37℃ ，１ h； (5)蒸餾水洗； (6)甘油明膠封固。 ４、結(jié)果與評價(jià) 乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶活性部位顯 棕色沉淀 。 Cu2+濃度太小易彌散， ，高于６易擴(kuò)散。 ５、對照 用 四異丙基焦磷酰胺 4mM(%) 堿酯酶 顯示乙酰膽堿酯酶； 用 毒扁豆堿硫酸酯 3 105M代替蒸餾水，先將切片處理 30分，水洗后入孵育液，則 二種酶均被抑制 呈陰性。 (二）生物學(xué)意義 膽堿酯酶的活性中心是 絲氨酸 。乙酰膽堿酯酶活性的強(qiáng)弱是 神經(jīng)細(xì)胞性質(zhì)和功能的重要參考指標(biāo) ，亦是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生過程中的 神經(jīng)細(xì)胞分化 的一個(gè)指標(biāo)，所以在形態(tài)上將乙酰膽堿酯酶的組織化學(xué)顯示作為 膽堿能傳遞部位的標(biāo)志。 AChE是 生物神經(jīng)傳導(dǎo) 中的一種關(guān)鍵性的酶，在膽堿能突觸間，該酶降解乙酰膽堿，終止神經(jīng)遞質(zhì)對突觸后膜的興奮作用，保證神經(jīng)信號在生物體內(nèi)的正常傳遞。 AChE與細(xì)胞凋亡 有一定的關(guān)系。在細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所用的各類細(xì)胞，正常狀態(tài)沒有 AChE活性反應(yīng)，一旦發(fā)生凋亡，都有 AChE活性反應(yīng)。用其特異的抑制劑可以抑制其活性反應(yīng)。用 RTPCR方法證明了凋亡細(xì)胞有 AChEmRNA的轉(zhuǎn)錄。加入其抑制劑石杉堿可降低凋亡基因的表達(dá)。 乙酰膽堿酯酶 主要分布于 神經(jīng)系統(tǒng)（大腦皮質(zhì)中有 AChE陽性的神經(jīng)纖維，還存在于膽堿能神經(jīng)元中） 、神經(jīng) 肌肉接頭處 、 紅細(xì)胞 等，而 膽堿酯酶 主要分布于 血清 、 胰腺 、 唾液腺內(nèi) 。 五、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶 (choline acetyltransferase, ChAc) 此酶不屬于羧酸酯水解酶，它是 乙酰膽堿的合成酶 。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的強(qiáng)弱是膽堿能神經(jīng)生理功能的標(biāo)志，因此將 ChAC確認(rèn)為膽堿能神經(jīng)的標(biāo)志酶。 （一）顯示方法 —— Burt法 反應(yīng)原理 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶可把 乙酰膽堿輔酶 A的乙?；D(zhuǎn)移到膽堿分子上 ,合成乙酰膽堿 。 輔酶 A被游離出來 ，輔酶 A中的 — SH被鉛離子沉淀而顯示酶的活性 。 乙酰輔酶 A+膽堿 乙酰膽堿 +輔酶 A Pb2+ 沉淀產(chǎn)物 PbS↓ 硫化銨 ChAc 孵育液 25mmol/L N2羥基乙基哌嗪 N2乙烷磺酸緩沖 液 （ HEPES） 4mmol/L 膽堿 （ ） （ ） 18mmol/L 硝酸鉛 （ ） (乙酰膽堿酯酶抑 制劑 ） （ ） 最終 pH值為 。 操作步驟 （ 1） 固定： 8μm厚的冰凍切片在 10%蔗糖和 2%戊二醛的 25mmol/LHEPES緩沖液 （ ） 中固定5min； （ 2 ） 漂洗： 用含 10% 蔗糖的 HEPES 緩沖液洗15min 3； （ 3） 孵育： 切片入孵育液中 ， 室溫 ， 3h； （ 30℃ ，1530min） ； （ 4） 蒸餾水洗 3次； （ 5） 1%硫化銨顯色 2min； （ 6）緩沖液漂洗，甘油明膠封固。 結(jié)果： 酶活性部位呈黑色沉淀 。 對照： （ 1） 孵育液中可除去輔酶 A； （ 2） 孵育液中去除膽堿 ， 反應(yīng)結(jié)果為陰性 。 （二）生物學(xué)意義 ChAc是 膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶 ，是乙酰膽堿的合成酶，分布在 膽堿能神經(jīng)元和纖維內(nèi) ，其含量的多少，可說明 神經(jīng)興奮性的高低 ，能充分反映神經(jīng)的功能。是了解膽堿能神經(jīng)元及其所支配器官的重要指標(biāo)。AChE是乙酰膽堿的水解酶，其特性沒有 ChAc高，兩酶相結(jié)合作觀察指標(biāo)最為理想。 六、脂酶 (Lipase) 脂酶又名甘油酯水解酶，能催化 長鏈脂肪酸甘油酯 或其它 醇酯 水解。 激活劑： Ca2+、 Sr2+、 Mg2+、半胱氨酸、巰基乙酸、?；悄懰猁}。 （一）顯示方法 —— 硫化鉛法（吐溫法之一， Gomori,1954) １、基本原理 以長鏈脂肪酸酯為底物，在脂酶作用下，分離出的脂肪酸可與鈣形成鈣皂沉淀，再用鉛置換鈣，最后經(jīng)硫化胺置換生成棕黑色硫化鉛沉淀。 吐溫 脂酶 脂肪酸 +Ca2+ 鈣皂 鉛置換鈣 硫化胺 PbS ２、孵育液 5%吐溫 60或 80硬脂酸酯（油酸酯） 2ml () 5ml 10%氯化鈣 2ml 蒸餾水 40ml ３、操作步驟 (1)恒冷箱切片； (2)入孵育液， 37℃, ２－３小時(shí)； (3)1%CaCL２ 液內(nèi)浸洗，使鈣皂不溶； (4) 1%Pb(NO3)2浸 15min， （置換）； (5)流水沖洗 5分； (6)%硫化胺液內(nèi)１ min， （顯色） ； (7)水洗３分； (8)甘油明膠封片。 ４、結(jié)果與評價(jià) 棕黑色 硫化鉛沉淀為脂酶活性所在部位。本法需 保持 Ca2+濃度 ，才有利于在Pb(NO3)2液內(nèi)進(jìn)行充分置換反應(yīng)。孵化時(shí)間過長，易彌散。 ５、對照 去出吐溫 60（底物）為陰性 （二）生物學(xué)意義 脂酶在體內(nèi)主要催化 甘油三酯水解 ， 使之成為二酰甘油和脂肪酸 ， 甘油三酯必須在脂酶將它分解成 甘油和脂肪酸 后 ， 才能被腸道吸收 。 脂肪細(xì)胞也需要脂酶水解脂肪 ， 以保證脂肪的外運(yùn) 。 脂酶的定位和組織分布： 脂酶主要存在于胞質(zhì)的基質(zhì)，高爾基復(fù)合體和線粒體也可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。 胰腺 最為豐富，其次是 肝臟、腎臟、脾臟 、唾液腺導(dǎo)管 （但大鼠極少）、胃賁門、睪丸基質(zhì)細(xì)胞中也存在。 Oxidase and Dehydrogenase 一、氧化還反應(yīng) 1. 生物體內(nèi)的氧化方式 (1) 脫電子反應(yīng)： 從底物上脫落一個(gè)電子。 Fe 2+ → Fe 3+ + e (2) 脫氫反應(yīng)： 從底物上脫落一對氫原子。 MH2 → M + 2H (2H+ + 2e) (3) 加氧反應(yīng)： 向底物中直接加入氧原子或氧分子。 催化上述反應(yīng)的