【文章內(nèi)容簡介】 250mL），由于實驗過程中才用碳源十種（ 淀粉，果糖，麥芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黃豆 粉）， 氮源五種（ 蛋白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸鉀，硫酸銨），在做碳源篩選的時候，分別用所選碳源代替高氏一號中的碳源淀粉；同理，在做氮源的時候，用所選氮源代替高氏一號培養(yǎng)基中的氮源硝酸鉀。用精準(zhǔn)天平分別稱取高氏一號培養(yǎng)基中所需試劑分量，稱取完畢后，分別加入 100ml 的蒸餾水，并將其密封，將培養(yǎng)基放入滅菌框中在立體 式電熱壓力蒸汽滅菌器 中滅菌 30分鐘（ 120℃），滅菌完成后，取出滅菌后的培養(yǎng)基，冷卻至室溫，在超凈工作臺里將菌株接種培養(yǎng)基中并密封，將接種的培養(yǎng)基放在搖床（ 28℃， 180rpm）環(huán)境下培養(yǎng) 7天， 7天后取出培養(yǎng)基，在超凈工作臺中，用移液槍從培養(yǎng)基中取菌液于 2ml 離心管中，菌液培養(yǎng)完成。 TMV 病毒液制作：取癥狀明顯感染 TMV 病毒的煙草葉片，并稱取其質(zhì)量，將病毒葉放入研缽中，加入少量的石英砂和 PBS（ Phosphate Buffered Saline ） 進行研磨，研磨大概 30分鐘，按照 1g 病毒葉配 100mLpbs 配置病毒液，完成后再加入適量的石英砂（有利于在接種的時候損傷葉片，從而更好的使煙草葉片感染 TMV），完成后將病毒液放入冰箱保存。 PBS（ Phosphate Buffered Saline ）PBS 1L 配方 ：磷酸二氫鉀 (KH2PO4)，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)，氯化鈉 (NaCl)，氯化鉀 (KCl)，加水至 1000mL。 ELISA:酶聯(lián)接免疫吸附劑測定 ( EnzymeLinked Immunosorbnent Assay )： ELISA 是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽 9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行 ，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計，具體的方法步驟可有多種。即 :用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是 ELISA 雙抗體夾心法及 ELISA 間接法。 檢測未知抗原的雙抗體夾心法 : 1. 包被：用 1～ 10μ g／ ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 ， 4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗 3次，每次 3 分鐘。 (簡稱洗滌，下同 )。 2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置 37℃孵育 1小時。然后洗滌。 (同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔 )。 3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 (經(jīng)滴定后的稀釋度 )。 37℃孵育 ～ 1小時，洗滌。 4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的 TMB底物溶液 ， 37℃10～ 30 分鐘。 5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入 2M 硫酸 。 6. 結(jié)果判定：可于白色背景上， 直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ +”、“ ”號表示。也可測 O D值：在 ELISA 檢測儀上，于 450nm(若以 ABTS 顯色，則 410nm)處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔 O D值，若大于規(guī)定的陰性對照 OD 值的 倍，即為陽性。 半葉枯斑法： 挑選健康且長勢一致的心葉煙， 將事先提取的 TMV病毒液混勻，并取出適量病毒液，采用摩擦接種的方法，將 TMV 病毒液接種到心葉煙的葉片上，由于接種損傷葉片，因此接種后葉片會有短暫的萎焉現(xiàn)象，將其放置34 小時，即待葉片基本恢復(fù)正常狀態(tài)，用毛筆將菌液均勻的涂在接種 TMV 病毒葉片的左半部分，每種菌液設(shè)置重復(fù) 23 次，菌液涂抹完成，做好標(biāo)簽，涂上菌液后 45 天統(tǒng)計結(jié)果，分別統(tǒng)計葉片左右的病斑數(shù)，并算出抑制率，可得出菌液的效果，通過活性得較優(yōu)碳源，氮源組分。 抑制率 =(對照枯斑數(shù)一處理枯斑數(shù) )／對照枯斑數(shù) 100％ 第二章 培養(yǎng)基優(yōu)化 菌株優(yōu)化 菌株培養(yǎng)基：以高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，所選碳源麥芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，果糖代替原培養(yǎng)基中的 2%淀粉，制作培養(yǎng)基，通過高溫滅菌，冷 卻至常溫，并接種 F02菌株； F07 菌株； F12 菌株； FZH菌株四種菌株在搖床（ 28℃， 180rpm）中培養(yǎng)七天。 活性測定：取出各個培養(yǎng)基中的對應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康，長勢基本一樣的心葉煙做活性測定。 結(jié)果及分析 單糖 重復(fù) 2菌株 平均抑制率 % 重復(fù) 1 重復(fù) 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麥芽糖 28 37 24 24 30 20 22 甘露糖 12 21 43 15 26 42 42 半乳糖 14 31 55 10 25 60 57 葡萄糖 29 36 19 16 14 06 12 果 糖 8 19 58 12 27 56 57 單糖 重復(fù) 7菌株 平均抑制率 % 重復(fù) 1 重復(fù) 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麥芽糖 7 8 13 8 5 0 13 甘露糖 6 7 14 9 14 36 25 半乳糖 4 15 73 7 9 22 47 葡萄糖 22 31 29 8 19 58 43 果 糖 5 9 44 6 16 63 53 單糖 重復(fù) 12菌株 平均抑制率 % 重 復(fù) 1 重復(fù) 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麥芽糖 6 9 33 10 9 0 33 甘露糖 8 10 2 3 8 62 41 半乳糖 4 8 50 2 4 50 50 葡萄糖 7 6 0 3 5 40 40 果 糖 9 17 47 12 13 08 28 單糖 重復(fù) ZH 菌株 平均抑制率 % 重復(fù) 1 重復(fù) 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 麥芽糖 18 20 10 13 16 19 15 甘露糖 19 27 30 14 17 18 24 半乳糖 21 28 25 7 19 63 44 葡萄糖 27 28 3 13 22 41 22 果 糖 12 13 8 31 32 03 5 通過五種不同的碳源培養(yǎng)基對 4種菌株抗病毒活性測定的結(jié)果可以看出， F02， F07兩種菌株的效果較好。 菌株培養(yǎng)基：以高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，所選碳源麥芽糖，甘露糖，果糖。葡萄糖，半乳糖，淀粉，黃豆粉，大米粉，小米粉，玉米粉。代替原培養(yǎng)基中的 2%淀粉，制作培養(yǎng)基，通過高溫滅菌，冷卻至常溫，并接種 F02菌株；F07 菌株 2種菌株在搖床（ 28℃， 180rpm）中培養(yǎng)七天。 活性測定：取出各個培養(yǎng)基中的對應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康，長勢基本一樣的心葉煙做活性測定。 結(jié)果及分析 單糖 重復(fù) 2菌株 平均抑制率 % 重復(fù) 1 重復(fù) 2 左 右 抑制率 % 左 右 抑制率 % 淀粉 5 6 17 52 53 2 玉米粉 2 5 60 20 24 17 小米粉 5 11 55 6 9 33 44 大米粉 5 5 0 13 18 28 28 黃豆粉 23 26 12 17 19 11 麥芽糖 28 37 24 24 30 20 22