【文章內(nèi)容簡介】 革蘭陽性菌及其芽孢的生長與繁殖， 特別是對金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯。是世界上公認的安全防腐劑，并極易被人體消化道中的一些蛋白酶和胰蛋白酶降解。Nisin作為一種生物防腐劑,其重要實用價值和理論價值得到了各國科研機構(gòu)的重視。同化學防腐劑相比，Nisin作為一種純天然生物防腐劑具有許多優(yōu)點隊目前制約Nisin應用的主要因素有兩個，一是生產(chǎn)成本太高, 二是純品提取困難傳統(tǒng)上Nisin發(fā)酵所用的培養(yǎng)基如MRS,M17,TGE 等有機氮含量都比較高, 這一方面增加了生產(chǎn)成本,另一方面由于培養(yǎng)基中含有較高濃度的多肽, 影響了的分離提純雖然前人研究了各種因子對產(chǎn)生Nisin的影響, 但僅以提高產(chǎn)量為最終目的，忽略了各種因子之間的交互作用對產(chǎn)Nisin的影響。我國目前乳鏈菌肽的生產(chǎn)由于成本較高,還沒有進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn),從而限制了乳鏈菌肽的應用。為了降低成本,形成規(guī)?；a(chǎn),必須對乳鏈菌肽發(fā)酵的各方面作深入研究。為了降低生產(chǎn)成本,形成規(guī)?；a(chǎn)，必須對乳鏈菌肽發(fā)酵的各方面作深入研究，尤其是乳酸鏈球菌培養(yǎng)基優(yōu)化方面至關重要。本文通過中心組合試驗設計方法克服了以上缺點優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基, 一方面在降低原料成本的同時提高了發(fā)酵單位, 另一方面由于發(fā)酵液中殘留的雜蛋白的減少可以降低其對提取的干擾, 間接地降低了成本[9]。2材料與方法 試驗材料凍干的乳酸鏈球菌10193菌種：來源于中國菌種保藏中心。脫脂乳粉：完達山牌脫脂乳粉金黃色葡萄球菌 由長江大學生命科學學院試驗室提供 試驗主要藥品及試劑 蔗糖，葡萄糖，乳糖，可溶性淀粉，蛋白胨，酵母膏，牛肉膏,瓊脂，Na2HPO412H2O，NaCI ，MgSO4，KH2PO4 ，吐溫 80，NaOH，無菌水。CM1培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖1O、蛋白胨1O、酵母膏1O、KH2PO4 NaCI M gSO4 ，pH [10]。檢測培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨8 、酵母膏5 、葡萄糖5 、NaCI Na2HPO412H2O2 、吐溫80 10 mL、 [11]?；罨囵B(yǎng)基（乳酸鏈球菌10193） ：12% 脫脂乳，% 葡萄糖， %酵母膏[12]?；罨囵B(yǎng)基（金黃色葡萄球菌）：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 試驗主要儀器及設備HH4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司801型離心機 上海手術(shù)器械廠722 S 可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司PL303電子天平 上海精密科學儀器有限公司顯微鏡 上海精密科學儀器有限公司 菌種的預處理（1）凍干乳酸鏈球菌10193活化[13]用酒精棉將菌種管玻璃表面擦拭消毒，而后于酒精火焰處打開管口（事先用玻璃刀或小砂片割出刻痕），以滅菌鉑耳環(huán)取之轉(zhuǎn)移至入滅菌脫脂乳試管中。將上述接種完畢的脫脂乳試管置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1224h，傳代培養(yǎng)直至恢復活力，即使乳達到在6小時內(nèi)凝固為止。本試驗采用兩種活化培養(yǎng)基，第一種為為12%脫脂乳，第二種為12%脫脂乳，%葡萄糖，%酵母膏，選擇出最佳培養(yǎng)基。（2）金黃色葡萄球菌的活化在無菌狀態(tài)下用接種環(huán)接金黃色葡萄球菌于滅菌后的蛋白胨酵母膏斜面培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每次活化之后均要涂片，Grams染色鏡檢，如菌種純一活力恢復，即可繼續(xù)試驗。若污染雜菌，則必須采用乳酸鏈球菌10193活化培養(yǎng)基（12%脫脂乳）重新分離培養(yǎng)，鏡檢無雜菌才可使用。用移液管移取1%傳代好的乳酸鏈球菌10193于100 mL CM1培養(yǎng)基中, 150 r/min搖床培養(yǎng),30℃，24 h。培養(yǎng)完畢后以體積百分數(shù)為10%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)24 h ，定時取樣, 檢測樣液OD620nm值及pH，并以杯碟法測乳酸鏈球菌10193素的抑菌圈平均直徑。 乳酸鏈球菌10193培養(yǎng)基優(yōu)化的單因素試驗以檢測培養(yǎng)基為基礎，以碳源、氮源、金屬離子、培養(yǎng)溫度為考察對象，以10%接種量,進行單因素試驗測定發(fā)酵液的pH值，吸光度值OD620nm,并以杯碟法測定發(fā)酵液的抑菌圈直徑，確定培養(yǎng)試驗菌株培養(yǎng)基的最優(yōu)組合。試驗方案如下：碳源種類對試驗菌株生長量的影響試驗：葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，乳糖氮源種類對試驗菌株生長量的影響試驗：牛肉膏，蛋白胨，酵母膏，混合氮源溫度的影響試驗：25℃，30℃，32℃，35℃，37℃金屬離子種類對試驗菌株生長量的影響試驗: K+, Mg2+, Zn2+, Ca2+，Ba2+，Cu2+按照上述 , 改變單一培養(yǎng)條件即培養(yǎng)溫度、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源，氮源，金屬離子種類, 探討乳酸鏈球菌10193菌株的適宜抑菌條件。 抑菌試驗 將培養(yǎng)一定時間的乳酸鏈球菌10193發(fā)酵液，5 400 r/min離心12 min，除去沉淀，收集上清液備用。采用杯碟法和濾紙片法。用于測定抗菌藥物體外抑制細菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗。（1）杯碟法：利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用，將已知效價的標準樣品和待測樣品的溶液分別加入試驗菌平板上的特制不銹鋼管（牛津杯）中，結(jié)果在抗生素抑菌濃度范圍內(nèi)，試驗菌不生長，出現(xiàn)透明的抑菌圈。測量其抑菌圈的大小，得到試驗指標。（2）紙片法：利用擴散原理，若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，在培養(yǎng)基上通過擴散在一定范圍內(nèi)形成抑菌濃度，便會在該菌落的周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，測量其抑菌圈的大小，得到試驗指標[11]。將金黃色葡萄球菌在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上充分活化，注入10ml 9%的生理鹽水，并用接種環(huán)輕輕刮拭，將菌懸液移入滅菌試管中，備用。（1）杯碟法：取無菌培養(yǎng)皿，加入融化的20 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為底層，凝固。將融化并冷卻至50℃60℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（100ml）加入金黃色葡萄球菌菌液35ml，充分混勻，立即取5ml均勻平鋪子已凝固的底層培養(yǎng)基上，凝固成為上層培養(yǎng)基。放置牛津杯(內(nèi)徑6．0 mm，高8．0 mm)，注意間距相等，每一因素更換移液管,使用游標卡尺測量抑菌圈直徑。（2）紙片法：以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為底層，凝固。，用涂布棒涂布均勻。將紙片沾取處理過的發(fā)酵液，均勻擺放于培養(yǎng)基之上，培養(yǎng)。在每個培養(yǎng)皿內(nèi)襯一層無菌濾紙，蓋上平板蓋，置30℃下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后取出平板，移去牛津杯或濾紙片，用游標卡尺測量各抑菌圈直徑。每組做3個重復，計算各組抑菌圈的平均值[13]。采用杯碟法與紙片法進行平行試驗，兩者抑菌效果相同，但濾紙片法誤差較小，結(jié)果更為明顯，方法簡單，因此采用紙片法作為抑菌試驗方法。如圖1所示。 圖1 杯碟法與紙片法對Nisin抑菌效果的比