【文章內(nèi)容簡介】 溶于水的HACTAB絡(luò)合物。而CTAB不會與生成HA的單體UDP葡萄糖酸和UDPN乙酰D氨基葡萄糖胺作用，從而保證了CTAB濁度法的準(zhǔn)確性和可行性。該方法可以有效提高菌株篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化以及發(fā)酵生產(chǎn)中HA產(chǎn)量日常監(jiān)測的工作效率。（2）硫酸咔唑法硫酸咔唑法是將硫酸咔唑液與HA溶液反應(yīng)，是一種測定HA的通用方法，在實驗中，人們通常將其作為一種基準(zhǔn)來評定其他測量方法的準(zhǔn)確性。在原先咔唑法的基礎(chǔ)上不斷改良，實驗工作者的不斷驗證和努力造就了今日一套成熟的硫酸咔唑法測定方式。它首先要用強酸將HA裂解成單糖單位[50]，通過葡萄糖醛酸與咔唑發(fā)生顯色反應(yīng)，間接測定HA含量，對強酸的純度和裂解條件要求較高，并且發(fā)酵液成分及雜質(zhì)對其精度干擾很大。硫酸咔唑法前處理需要很長的時間，且對樣品純度要求較高，此法在CTAB比濁法未得到推廣以前一直應(yīng)用廣泛。在實際測量中測得結(jié)果往往與實際情況不符，實驗證明中性糖的存在對測定結(jié)果又較大影響，因而在測量中要消除發(fā)酵液中中性糖的影響是十分必要的。 透明質(zhì)酸的提取純度和相對分子量的高低決定了HA產(chǎn)品國際市場中的競爭力，下游分離純化工藝是獲得高純度、高分子量HA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[51]。由于含HA的發(fā)酵液粘稠度很高，不易將HA與菌體快速有效分離[52]，并且菌體發(fā)酵生產(chǎn)HA過程中所產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶會降解HA，使HA分子量降低。故在進(jìn)行HA產(chǎn)品分離純化時首先要對發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐舛认♂?，盡快滅酶、滅菌、除菌等預(yù)處理[53]。分離工藝常用方法[54]有：乙醇分離，膜技術(shù)分離，殼聚糖分離。純化工藝主要有：季銨鹽純化，酶解純化，過濾法純化，離子交換層析純化，凝膠過濾柱層析純化。發(fā)酵液中分離純化HA一般是由多種分離純化方法共同完成的，單一的分離純化方法不能使HA產(chǎn)品達(dá)到很高的純化程度，并且每種分離純化方法也都存在一定的局限性[55]。因此，應(yīng)根據(jù)發(fā)酵液的特性和分離純化方法的特點找到合適的分離純化工藝路線。 課題研究內(nèi)容和目的 本課題研究內(nèi)容（1）透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌的篩選鑒定和誘變選育。（2）優(yōu)化CTAB比濁法，建立一種更快捷、更精確、更準(zhǔn)確和更高效HA含量檢測方法。（3）通過基因工程技術(shù)，對篩選到的菌株進(jìn)行改造，獲得更安全高效的工程菌株。（4）尋找透明質(zhì)酸發(fā)酵的最優(yōu)條件，研究添加劑對發(fā)酵生產(chǎn)HA的影響。 本課題主要目的篩選并鑒定產(chǎn)透明質(zhì)酸的菌株，利用物理方法和化學(xué)試劑誘變除去菌株的溶血性，對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，降低菌株較為苛刻的營養(yǎng)要求，提高HA產(chǎn)量；對菌株的透明質(zhì)酸合酶基因進(jìn)行克隆和序列分析，對通過基因工程技術(shù)改造生產(chǎn)菌株進(jìn)行必要的前期探索。642 透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌的分離、篩選與初步鑒定2 透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌的分離、篩選與初步鑒定在微生物發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸過程中，獲得優(yōu)良的菌種非常關(guān)鍵。目前報道的高產(chǎn)透明質(zhì)酸菌株主要屬于鏈球菌類，而牛鼻粘膜是鏈球菌較容易生長的地方。本實驗采樣于連云港贛榆縣養(yǎng)牛場中的牛鼻粘膜共160份，目的在于從中篩選到一株透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌，并對其進(jìn)行初步鑒定。 實驗材料 采樣連云港贛榆縣贛榆村養(yǎng)牛場牛鼻粘膜160份。 主要培養(yǎng)基及溶液組成 血瓊脂培養(yǎng)基葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，Tryptone 1%，MgSO47 H2O %，KH2PO4 %，%，115℃滅菌20 min，冷卻至40℃以下，無菌條件下加入無菌脫纖維羊血。 搖瓶培養(yǎng)基葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，Tryptone 1%，beef extract l%，MgSO47 H2O %，KH2PO4 %，115℃滅菌20 min，冷卻至40℃以下，無菌條件下加體積分?jǐn)?shù)10%的小牛血清。 斜面培養(yǎng)基牛腦浸液800 mL，牛心浸液200 mL，beef extract %，Tryptone %，NaCl %，%，pH ，121℃滅菌20 min。 種子培養(yǎng)基%，Tryptone %，Yeast extract %，NaH2PO4 %，NaCl %，滅菌前pH ，115℃滅菌20 min。 呂氏美藍(lán)染液A液：美藍(lán)（Methylene blue，又名甲烯藍(lán)） g，95%乙醇 30 mL。B液： g/L KOH溶液 100 mL?；旌螦液和B液即成，用于細(xì)菌單染色，可長期保存。根據(jù)需要可配成稀釋美藍(lán)液，按1:10或1:100稀釋均可。 革蘭氏染色所用染液① 結(jié)晶紫(crystal violet)液：A． 結(jié)晶紫 2 g 乙 醇 20 mLB． 草酸銨 g 蒸餾水 80 mL將A、B液相混合，放置24 h后使用。此液比較穩(wěn)定，可保存數(shù)月。② 碘液：取1 g碘片與2 g KI相混，加12 mL蒸餾水研磨，然后可再加34 mL蒸餾水研磨，直到碘片溶解為止。然后將此液用少量的蒸餾水洗入貯瓶內(nèi)，并補足到總量為100 mL蒸餾水，即為碘液母液。此溶液穩(wěn)定，可放置數(shù)月。使用時，取1份上述碘液加2份蒸餾水，即為革蘭氏染色用碘液。③ 95%乙醇：用于脫色。④ 番紅花紅液： g，95%乙醇100 mL，溶解后可貯存于密閉的棕色瓶中，用時取20 mL與80 mL蒸餾水混勻即可。 實驗方法菌種的篩選流程：牛鼻黏膜 稀釋涂平板 初篩菌株 純種分離 復(fù)篩菌株 發(fā)酵液HA提取 定性分析 目的菌株 斜面培養(yǎng) 菌種鑒定 透明質(zhì)酸的分離純化 透明質(zhì)酸的粗提發(fā)酵液6000 rmp離心10 ，攪拌20 min，經(jīng)多次乙醇分級沉淀后得到HA粗品。 CTAB絡(luò)合 mol/L NaCl溶液中，加入體積分?jǐn)?shù)10%的十六烷基三甲基溴化銨，攪拌30 min后靜置1 h，6000 rpm離心10 min得到沉淀絡(luò)合物。 HA精提不同濃度的NaCl解離沉淀絡(luò)合物，離心去除沉淀，沉淀在五氧化二磷存在下常溫真空干燥得HA精品。 菌種的篩選 采樣棉簽采集牛鼻粘膜160份，此處是鏈球菌容易生長的地方。 初篩%的蛋白胨溶液，用梯度稀釋倍數(shù)法將牛鼻黏膜稀釋成不同的濃度，涂布棒均勻涂布于血瓊脂平板培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落的溶血性和形態(tài)。 分離純化血瓊脂平板上挑取溶血素缺陷型菌株，作為初篩疑似菌株進(jìn)行劃線分離，將血平板在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進(jìn)行美蘭染色，顯微鏡觀察，若菌落中有雜菌存在，則繼續(xù)劃線分離，再培養(yǎng)，直到染色后菌落單一無雜菌。 復(fù)篩將初篩疑似菌株接入搖瓶培養(yǎng)基中，每株2瓶，120 rpm/min，37℃的搖床中空氣振蕩培養(yǎng)24 h，復(fù)篩發(fā)酵液進(jìn)行HA精提，對得到的多糖精品紅外吸收光譜定性分析。 菌種的初步鑒定根據(jù)鏈球菌常用的鑒定方法，進(jìn)行菌株的培養(yǎng)特征和生長特征觀察。 菌落培養(yǎng)特征純化好的菌種，用接種環(huán)接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落形態(tài)和溶血性觀察。 菌種的鏡檢選擇在基本培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，經(jīng)染色后，在顯微鏡下測量菌體的大小，觀察菌體的形狀、排列方式或分枝的情況等，觀察細(xì)菌的革蘭氏反應(yīng)，有無莢膜等。 實驗結(jié)果與討論 菌種的篩選 初篩結(jié)果%的蛋白胨溶液稀釋成不同濃度后，分別涂于血瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，在兩塊平板上分別發(fā)現(xiàn)3株明顯溶血性菌種，從圖21和22中可以看出平板2中的菌落周圍形成34 mm寬、界限清晰、完全透明的溶血環(huán)，說明該菌株溶血性較強，而平板1中的菌落周圍形成12 mm寬、不完全透明的溶血環(huán)。根據(jù)相關(guān)資料報導(dǎo)，HA產(chǎn)生菌一般分為乙型溶血性鏈球菌，甲型溶血性鏈球菌以及無溶血現(xiàn)象的丙型鏈球菌。初步推斷平板1中菌落為乙型溶血，平板2中菌落為甲型溶血。 圖 21 乙型溶血菌落 圖22 甲型溶血菌落Fig 21 βhemolytic streptococcus Fig 22 α hemolytic streptococcus 復(fù)篩結(jié)果血瓊脂平板上挑取溶血素缺陷型菌株，作為初篩疑似菌株進(jìn)行劃線分離，將血平板在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落進(jìn)行美蘭染色，顯微鏡觀察，若菌落中有雜菌存在，則繼續(xù)劃線分離，再培養(yǎng)，直到染色后菌落單一無雜菌。3只250 mL錐形瓶，分別裝入50 mL搖瓶培養(yǎng)基，并接入初篩疑似菌株，將錐形瓶放入37℃空氣浴搖床中，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm/min，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)24 h。采用HA精提法對發(fā)酵液進(jìn)行分離提純，用紅外分光光度計對得到的多糖精提物產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。圖23 HA標(biāo)樣紅外吸收圖譜Fig 23 Infrared absorption spectrum of HA standard sample圖24 HA精提物紅外吸收圖譜Fig 24 Infrared absorption spectrum of HA refined extracts從圖24可以看出，發(fā)酵液多糖精提物的紅外吸收圖譜在3420 nm附近有強OH伸縮振動的特征吸收峰，說明有多羥基結(jié)構(gòu)；在2920 nm附近有CH2的伸縮振動的特征吸收峰，1650和1560 nm處有CO、CN的伸縮振動的特征吸收，表明含有乙酰氨基結(jié)構(gòu)；在141310 nm處有COC的伸縮振動和OH的彎曲振動耦合產(chǎn)生的2個吸收峰，表明存在著有解離羧基結(jié)構(gòu)和多糖羥基結(jié)構(gòu)的糖醛酸。篩選菌株的發(fā)酵液精提物呈較典型的HA紅外吸收圖譜，可以確定該發(fā)酵液多糖精提物為透明質(zhì)酸。根據(jù)以上分析，也可以進(jìn)一步確定篩選得到的鏈球菌可以產(chǎn)生HA。 菌種的分類鑒定菌落周圍有透明的溶血圈，菌落直徑12 mm，透明度很高，灰白色隆起，接種環(huán)挑起呈蛋清狀黏連。 菌種鏡檢結(jié)果細(xì)菌染色鏡檢，篩選菌株在固體平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)物大部分為短鏈成對或聚集成叢的葡萄球菌，接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，培養(yǎng)物則基本呈長鏈狀。革蘭氏染色呈陽性，濕墨汁法莢膜染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)有明顯莢膜。圖25 革蘭氏染色Fig 25 Gram stain 本章小結(jié)從取自連云港贛榆養(yǎng)牛場的牛鼻黏膜中成功篩選到一株透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征，溶血性，以及染色結(jié)果，初步鑒定為獸疫鏈球菌。通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，分離提取發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸，得到多糖粗品，紅外光譜掃描顯示此多糖為透明質(zhì)酸。3 透明質(zhì)酸含量檢測方法建立3 透明質(zhì)酸含量檢測方法建立高效快速地測定發(fā)酵液中HA的含量不僅能提高篩選透明質(zhì)酸高產(chǎn)菌株的效率，而且對發(fā)酵條件的優(yōu)化及工藝控制有非常重要的意義。目前最常用的測定發(fā)酵液中HA含量的方法是BitterMuir法，其原理是用強酸將HA裂解成單糖單位，通過葡糖醛酸與咔唑顯色反應(yīng)間接測定HA含量。最近有報道采用更簡便的CTAB比濁法，其原理是HA在溶液中可與十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等陽離子表面活性劑發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生混濁現(xiàn)象，并在一定濃度范圍內(nèi)遵循朗伯比爾定律。本實驗對上述兩種方法分別進(jìn)行優(yōu)化，并比較二者用于檢測發(fā)酵液中HA含量的優(yōu)劣。 實驗材料 主要儀器SZ3型自動三重純水蒸餾器 上海滬西分析儀器廠有限公司KTFDL1封閉式可調(diào)電爐 上海賀德實驗設(shè)備有限公司FA1104電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司G53紫外可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司DHG9104A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司HZQC型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠TGL16B高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠 主要試劑（1）透明質(zhì)酸標(biāo)準(zhǔn)品（醫(yī)用級）；（2）發(fā)酵液： g/L蛋白胨， g/L酵母粉， g/L葡萄糖，2 g/L NaCl， g/L Na2HPO4；（3）CTAB溶液： g CTAB溶于100 mL 2%NaOH溶液中， g CTAB溶于100 mL 2%NaCl溶液中；（4）咔唑試液：25 mg咔唑溶于20 mL無水乙醇中；（5）乙酸緩沖溶液： mol/L CH3COONa， mol/L NaCl，；（6）磷酸緩沖溶液： mL mol/L NaH2PO， mol/L Na2HPO4；（7）TrisHCl緩沖液：50 mL mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris） mL mol/L 鹽酸混勻后，加水稀釋至100 mL。 實驗方法 透明質(zhì)酸的初步純化%（w/v）十二烷基磺酸鈉（SDS）等體積混合，室溫溫浴10 min以釋放細(xì)胞外壁附著的HA。經(jīng)4500 r/min離心10 min，去除菌體，取上清液，在4℃靜置1 h，12000 r/min離心取沉淀，加入與發(fā)酵液等體積的去離子水溶解[56]，取1 mL進(jìn)行HA測定。 CTAB比濁法適量濃度的透明質(zhì)酸溶液與乙酸緩沖液混合，終體積為1 mL，室溫加入2 mL一定濃度的CTAB溶液均勻混合，反應(yīng)一定時間后在特定波長下測定混合液的濁度A。根據(jù)A與HA濃度之間的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 改良BitterMuir法3 mL濃硫酸置于試管中，1 mL樣液或HA標(biāo)準(zhǔn)液小心置于濃硫酸上層，開始輕輕振搖，然后劇烈振搖，并使之在冰浴中不斷冷卻，將試管在沸騰的去離子水中加熱一定時間， mL咔唑試液，再次搖勻，在沸水浴中加熱一定時間，冷卻至室溫，在特定波長下測定吸光度A。 結(jié)果與討論 CTAB比濁法 緩沖溶液對反應(yīng)體系的影響為考察不同緩沖溶液對HACTAB反應(yīng)體系吸光度的影響，本實驗分別稱取9 mg HA標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100 mL乙酸緩沖液、磷酸緩沖液、TrisHCl緩沖液和去離子水中，配制成濃度均為90 181。g/mL的HA標(biāo)準(zhǔn)液。并分別與25 g/L的CTAB溶液反應(yīng)10 min，在200800 nm波長范