【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 提高了 4 倍；I/S 為 880，是野生菌的 16 倍 [9]。 不同條件對(duì)微生物合成菊粉酶的影響(1)碳源的影響菊粉酶通常認(rèn)為是一種誘導(dǎo)酶。大多數(shù)的研究結(jié)果一致認(rèn)為，以菊粉作為碳源比以其它糖作碳源產(chǎn)菊粉酶活力高，且不同碳源對(duì)野生菌株和誘變菌株的影響不同。Thonart研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘油、乙醇對(duì)經(jīng) NTG 誘變過的菌株有誘導(dǎo)作用，而對(duì)野生菌株無誘導(dǎo)作用 [9]。Fontana 等人用菊粉的衍生物己酸化菊粉和膽固醇菊粉作碳源，發(fā)現(xiàn)己酸化菊粉是最好的誘導(dǎo)物，其酶活比用菊粉作誘導(dǎo)物提高了 419816 倍 [10]。這可能是山于己酸化菊粉不僅是更有效的誘導(dǎo)物，而且菊粉上的輕基被酷化后連接上的脂肪鏈有表而活性劑的作用，使得誘導(dǎo)物更易聚集在細(xì)胞壁上，從而改變了細(xì)胞壁的穿透能力，增加了對(duì)誘導(dǎo)物的吸收。Gupta 等人發(fā)現(xiàn)用從菊芋根中提取出來的果聚糖作碳源(開花前含很少量的葡萄糖和果糖)，比用菊粉作碳源，酶活力有很大提高 [9]。也有人認(rèn)為菊粉酶是組成型酶，當(dāng)馬克斯克魯維酵母()在以甘油作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)也產(chǎn)菊粉酶。(2)氮源的影響在不同的培養(yǎng)條件下，對(duì)于不同菌株，氮源的影響也不同。Gupta 等人研究了不同氮源對(duì)克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)產(chǎn)菊粉酶的影響，發(fā)現(xiàn)以蛋白胨作氮源時(shí)產(chǎn)菊粉酶活力最高 [7]。Kin 等人研究了各種無機(jī)氮源對(duì)青霉菌(Penicillium)產(chǎn)菊粉酶的影響，蛋白胨和玉米漿作氮源能提高產(chǎn)酶量，而脲和酵母膏影響不大 [22]。在無機(jī)氮源中，以(NH 4)2HPO4和（NH 4)H2PO4 作氮源產(chǎn)酶量最高，(NH 4)2SO4，NH 4C1，NH 4NO3 和 KNO3 也能促進(jìn)產(chǎn)酶量提高 [6]。(3)無機(jī)磷源的影響在培養(yǎng)基中加入磷源 NaH2PO4 %和 KH2PO4 %，產(chǎn)酶活力比不加磷源高 [6]。(4)不同金屬離子和微量元素的影響Kim 和 Nakamura 等人發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加 FeS04， 4， 能使青霉菌(Penicillium )和黑曲霉() 的產(chǎn)酶量分別提高 32%，26%，12% [3]。(5)溫度的影響克魯斯假絲酵母(Candidacrusei) 產(chǎn)酶的最適溫度為 2730℃，溫度提高將導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低?？唆斁S酵母(Kluyveromyces waltii)產(chǎn)酶的最適溫度為 3040℃[21]。真菌達(dá)到最大生長(zhǎng)量和最高酶活的溫度范圍為 2734℃，如黑曲霉(Aspergillus niger) 的最適產(chǎn)酶溫度為 30℃，青霉菌(Penici1lium )為 3033℃[12]。 菊粉酶的分布不同菌種菊粉酶的分布不一樣，Rottweatlioist 等人報(bào)道酵母有 50%酶在胞外。Margaruttes 報(bào)道酵母有 25%的酶在胞外，75% 在胞壁和胞內(nèi) [11]。培養(yǎng)條件也影響菊粉酶的分布，對(duì)于克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)以 pH 影響最大，低 pH 高溫下有利于菊粉酶釋放于胞外，pH ,35℃下培養(yǎng)時(shí)，胞外有菊粉酶。而 pH 時(shí)胞外無菊粉酶 [20]。對(duì)于馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus)以玉米漿和菊粉作培養(yǎng)基時(shí)，胞外酶最多，而以酵母膏和菊粉作培養(yǎng)基時(shí)胞內(nèi)酶最多，隨著培養(yǎng)溫度的提高胞外酶的比例下降胞壁酶和胞內(nèi)酶的比例上升 [9]。 菊粉酶的純化對(duì)于混合酶，酶的純化步驟一般分為:(NH) 2SO4 沉淀、離子交換層析及凝膠過濾色譜等。離子交換層析可用來選擇性地分離外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶，通常用 NaCl 進(jìn)行線性梯度洗脫，隨著 NaCl 濃度增加，內(nèi)切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出。有些微生物菊粉酶不宜用(NH) 2SO4 沉淀如 var 菊粉酶用(NH) 2SO4 沉淀易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷凍干燥 [14]。Pessoa 等人研究了酵母胞外菊粉酶的純化，在離子色譜柱上，對(duì)于弱陰離子交換劑 DEAE，最佳吸附 pH 為 ，對(duì)于強(qiáng)陰離子交換劑，最佳吸附pH 為 [19]。 菊粉酶為糖蛋白，含糖量為 26%37%，低聚糖以糖苷鍵的形式與酶蛋白中的天門冬酰胺殘基相連，純化后的菊粉酶在 SDSPAGE 和活性電泳中表現(xiàn)出幾條譜帶是出于各組分含糖量不同所造成的，用 EndoH 去除酶蛋白中的糖后，在電泳中得到單一譜帶 [13]。 菊粉酶的性質(zhì)不同菌種所產(chǎn)菊粉酶的性質(zhì)有所不同。無花果曲霉() 菊粉酶經(jīng)純化得到三種酶 :外切酶 I、外切酶 II 和內(nèi)切酶 I，三種酶分子量分別為 42,900Da、43,400Da 、47,200Da 。外切酶 I 和外切酶 II 以菊粉和蔗糖作為底物時(shí)，其最適反應(yīng)溫度分別為 60℃和 65℃,最適 pH 均為 ；降解菊粉所需最低活化能分別為 2211kJ/mol 和 3319kJ/mol；降解蔗糖所需要低活化能分別為 2217kJ/mol 和2815kJ/mol；內(nèi)切酶 I 降解菊粉所需最低活化能為 1mmol/L[16]。外切酶水解蔗糖的活力與轉(zhuǎn)化酶相同，內(nèi)切酶兒乎不水解蔗糖，Hg 2+、Ag +、Mn +強(qiáng)烈抑制酶活，說明酶活性中心有SH 基因， Ca2+使酶活增加，吲哚乙酸、EDTA ,磷酸毗哆醇對(duì)酶活沒有顯著影響 [9]。黑曲霉() 內(nèi)切菊粉酶分子量 ，只水解菊粉不水解蔗糖，最適溫度為45℃， 40℃以下穩(wěn)定， 50℃以上開始失活，80℃時(shí)完全失活，最適 pH ，pH 時(shí)酶活為 100%pH 時(shí)酶活為 76%，pH 時(shí)酶活為 51%，pH 時(shí)酶完全失活 [5]。外切酶的反應(yīng)機(jī)理為單鏈反應(yīng)，以菊粉為底物，以葡萄糖的生成速度、果糖與葡萄糖之比的變化速度為依據(jù)來判斷，水解反應(yīng)一般為單鏈反應(yīng)，即一次只水解一條鏈；pH對(duì)此作用機(jī)制有影響， 時(shí)，較多地傾向于多鏈反應(yīng)， pH 時(shí)為單鏈反應(yīng) [18]。 研究的目的意義我國(guó)在菊粉酶研究和應(yīng)用中的主要困難：產(chǎn)酶成本高，導(dǎo)致應(yīng)用成本高。因此本研究針對(duì)這一問題，對(duì)耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌進(jìn)行高產(chǎn)菌株的分離，并針對(duì)分離菌種產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以期能夠得到低溫下即可分泌菊粉酶的高產(chǎn)菌株，實(shí)現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應(yīng)用普及。2 材料與方法 樣品 腐爛的菊芋，保藏于生化實(shí)驗(yàn)室 4℃的冷柜中； 培養(yǎng)基(1)斜面保藏培養(yǎng)基：牛肉膏 %，蛋白胨 1%，氯化鈉 %，瓊脂 %，pH 調(diào)至；(2)分離培養(yǎng)及：(NH 4)2SO4 %，MgSO 47H2O %，K 2HPO4 %，菊粉 %，瓊脂 %， ；(3)初篩培養(yǎng)基：同分離培養(yǎng)基；(4)復(fù)篩培養(yǎng)基：(NH 4)2SO4 %，K 2HPO4 %，酵母膏 %，菊粉 %，pH ；(5)種子培養(yǎng)基：同復(fù)篩培養(yǎng)基配方 主要試劑表 21 主要試劑表Table 21 The Main reagent list藥品名稱 品級(jí) 制造商菊粉 食品級(jí) 廣州澤鈺生物科技有限公司豆粕 食品級(jí) 阜新維遠(yuǎn)食品科技有限公司磷酸氫二鉀 分析純 沈陽市東興試劑廠硫酸鎂 分析純 沈陽市新西試劑廠硫酸銨 分析純 沈陽市新西試劑廠氯化鈣 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司氯化鉀 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司氯化鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司氫氧化鈉 分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠無水硫酸鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司苯酚 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司酒石酸鉀鈉 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司3,5二硝基水楊酸 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司冰醋酸 分析純 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司吐溫80 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司D果糖 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司 主要儀器設(shè)備表 22 主要儀器設(shè)備表Table 22 The main instrument equipment list酵母膏 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司蛋白胨 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司牛肉膏 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司瓊脂 生化試劑 國(guó)藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司名稱 型號(hào) 制造商精密 PH 計(jì) PHS3C 型 上海精密科學(xué)儀器有限公司電子分析天平 FA2104N 上海精密科學(xué)儀器有限公司高速冷凍離心機(jī) KDC160HR 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司振蕩培養(yǎng)箱 BS2F 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司恒溫培養(yǎng)箱 DNP9052 型 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 GZX9070MBE 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司超凈工作臺(tái) SWCJ2F1D 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療 設(shè)備廠冰箱 BCD201Q 上?？坡‰娖髯贤饪梢姺止夤舛扔?jì) UV752 上海欣茂儀器有限公司恒溫水油浴鍋 MF5000 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公 司電爐 JYC19BE2 山東九陽小家電有限公司電磁爐 JYC19BE2 山東九陽小家電有限公司 技術(shù)路線及操作要點(diǎn) 技術(shù)路線 圖 21 技術(shù)路線圖Figure 21 technology roadmap 操作要點(diǎn)(1)采樣菌源來自于實(shí)驗(yàn)室一盆低溫保存的腐爛菊芋，采樣時(shí)要各個(gè)部位（垂直方向到水平方向）都采集到，至少做到垂直方向上中下三層，水平方向八個(gè)方位，以保證菌種采集充分，為下一步篩選高產(chǎn)菌株做準(zhǔn)備；采集后的樣品于玻璃瓶?jī)?nèi) 4℃冰箱低溫保藏（共 24瓶） 。(2)菌種分離從保藏的樣品中適量挑取約 1g 放入盛 99mL 無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，震搖至少 20 分鐘，待其完全混合，細(xì)胞分散開后，用一支 1mL 無菌吸管從中吸取 1mL 樣品溶液加入事先準(zhǔn)備好的內(nèi)盛 9mL 無菌水的大試管中，充分混合；然后用無菌吸管從此試管中吸取 1mL 加入另一事先預(yù)備好的內(nèi)盛 9mL 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 103,104,105,106,107,108 不同稀釋度的樣品稀釋液，通過初步菌種分離選出最適稀釋度；按分離培養(yǎng)基配方制作好三份平板，分別標(biāo)記 （每份平板準(zhǔn)備 3 個(gè)，即A1A2A3，B 1B2B3，C 1C2C3 共 9 個(gè)，下小標(biāo)表示三個(gè)最適稀釋濃度）倒置放置；A取上層醫(yī)用高壓蒸汽滅菌鍋 EST056 錦州科學(xué)儀器醫(yī)療設(shè)備廠樣品，B取中層樣品，C取下層樣品；用無菌吸管分別從上述 103 至 108 樣品稀釋液中各吸取 或 小心的滴于準(zhǔn)備好