【正文】 為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，選定豆粕添加量 %、初始 pH 值 、氯化鈣添加量 %，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過 3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶實(shí)際酶活力的平均值為 ，與理論預(yù)測(cè)值 ，相對(duì)誤差為 %，說明該回歸模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性很高。表 34 各因素的主要效應(yīng)表Table 34 main effect factors of the table 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(1)因素水平的選取選取豆粕添加量、初始 pH、CaCl 2 添加量三個(gè)在發(fā)酵過程中對(duì)菊粉酶活性影響較顯著的三個(gè)因素，根據(jù) BoxBeknhen 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖22。(2)菌種分離從保藏的樣品中適量挑取約 1g 放入盛 99mL 無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，震搖至少 20 分鐘，待其完全混合，細(xì)胞分散開后，用一支 1mL 無菌吸管從中吸取 1mL 樣品溶液加入事先準(zhǔn)備好的內(nèi)盛 9mL 無菌水的大試管中，充分混合；然后用無菌吸管從此試管中吸取 1mL 加入另一事先預(yù)備好的內(nèi)盛 9mL 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 103,104,105,106,107,108 不同稀釋度的樣品稀釋液，通過初步菌種分離選出最適稀釋度；按分離培養(yǎng)基配方制作好三份平板，分別標(biāo)記 （每份平板準(zhǔn)備 3 個(gè)，即A1A2A3，B 1B2B3，C 1C2C3 共 9 個(gè)，下小標(biāo)表示三個(gè)最適稀釋濃度）倒置放置；A取上層醫(yī)用高壓蒸汽滅菌鍋 EST056 錦州科學(xué)儀器醫(yī)療設(shè)備廠樣品，B取中層樣品，C取下層樣品；用無菌吸管分別從上述 103 至 108 樣品稀釋液中各吸取 或 小心的滴于準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基表面中央位置；用無菌涂布器涂布：右手拿無菌涂布器平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。對(duì)于馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus)以玉米漿和菊粉作培養(yǎng)基時(shí)，胞外酶最多，而以酵母膏和菊粉作培養(yǎng)基時(shí)胞內(nèi)酶最多，隨著培養(yǎng)溫度的提高胞外酶的比例下降胞壁酶和胞內(nèi)酶的比例上升 [9]。這可能是山于己酸化菊粉不僅是更有效的誘導(dǎo)物，而且菊粉上的輕基被酷化后連接上的脂肪鏈有表而活性劑的作用，使得誘導(dǎo)物更易聚集在細(xì)胞壁上，從而改變了細(xì)胞壁的穿透能力，增加了對(duì)誘導(dǎo)物的吸收。另外，嚴(yán)奉偉等已經(jīng)開始進(jìn)行菊粉軟糖的試制。也就是說，一定的底物可以誘導(dǎo)生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物對(duì)酶的活性影響很大。本文旨在從自然界選育產(chǎn)菊粉酶的微生物，并研究了產(chǎn)酶活力較高的一株細(xì)菌的最優(yōu)發(fā)酵條件，為實(shí)現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應(yīng)用普及打下基礎(chǔ)。目前均停留于實(shí)驗(yàn)室階段，限制因子在于：產(chǎn)酶菌株菊粉酶產(chǎn)量低，產(chǎn)酶成本高。 菊粉酶的理化性質(zhì)(1)熱穩(wěn)定性：菊粉酶最適溫度在 5264℃之間，5558℃最適宜；(2)最適 pH：菊粉酶最適 pH 為弱酸性，這一性質(zhì)不僅操作安全，而且使用過程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩(wěn)定的 pH 值 [10]；(3)底物專一性：使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導(dǎo)產(chǎn)生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。國(guó)外有報(bào)道指出，用 （一種酵母菌株）或 (一種酵母菌株)發(fā)酵菊粉生產(chǎn)酒精，（一種黑曲霉菌株）轉(zhuǎn)化率為 90%以上(v/v)，后兩者幾乎能完全將菊粉發(fā)酵成酒精。大多數(shù)的研究結(jié)果一致認(rèn)為，以菊粉作為碳源比以其它糖作碳源產(chǎn)菊粉酶活力高，且不同碳源對(duì)野生菌株和誘變菌株的影響不同。Margaruttes 報(bào)道酵母有 25%的酶在胞外，75% 在胞壁和胞內(nèi) [11]。因此本研究針對(duì)這一問題，對(duì)耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌進(jìn)行高產(chǎn)菌株的分離，并針對(duì)分離菌種產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以期能夠得到低溫下即可分泌菊粉酶的高產(chǎn)菌株，實(shí)現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應(yīng)用普及。表 24 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案Table 24 The response surface design scheme 菊粉酶活力的測(cè)定方法(1)主要試劑的配制 試劑的配制稱取酒石酸鉀鈉 ，溶于 500mL 蒸餾水中，加熱（不超過 50℃） ，于熱溶液中依次加入 3,5二硝基水楊酸 ，NaOH ，苯酚 ，無水亞硫酸鈉 ，攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至 1000mL，貯存于棕色瓶中，4℃低溫保存；依次加入藥品時(shí)，要一點(diǎn)點(diǎn)緩慢加入，溶一點(diǎn)加一點(diǎn)，不能顛倒順序；%菊粉溶液的配制取醋酸鈉 18g，加冰醋酸 ，加水稀釋成 1000mL 即得；得到的醋酸鈉溶液用 范圍的 pH 紙粗略的檢驗(yàn)其 pH 值即可；然后稱取 2g 菊粉溶于適量的上述醋酸鈉溶液中，由于菊粉在常溫下不易溶解，溶液呈白色渾濁狀，所以對(duì)其稍微加熱，并不斷攪拌加速其溶解，至溶液呈無色透明即可，將其轉(zhuǎn)至 100mL 容量瓶中，加醋酸鈉溶液至刻度值即得到 2%菊粉溶液。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi) XX 5 和 X8 對(duì)菊粉酶活力均有顯著影響 (P＜)，其他因素在所考察的水平范圍內(nèi)對(duì)酶活力的影響不顯著。即在豆粕添加量 %，初始 pH ，氯化鈣添加量 %的條件下，以菊粉為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵的菊粉酶活力值最大，由回歸方程預(yù)測(cè)在此條件下的菊粉酶活力理論值為。由于各個(gè)研究所使用的菌種不同且都是自己分離，純化的，菌種產(chǎn)地的不同，菌種在當(dāng)?shù)亟?jīng)過長(zhǎng)期的生長(zhǎng)繁殖適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐奶厥猸h(huán)境，而實(shí)驗(yàn)的菌種僅僅經(jīng)過短期的分離馴化，這很難改變菌種的性能，許多的特殊野生性狀未發(fā)生改變，這也是許多文獻(xiàn)的都對(duì)產(chǎn)菊粉酶菌株進(jìn)行分離及發(fā)酵條件研究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不同的原因。X9 1 X10 1 模型 10 *誤差項(xiàng) 1 總和 11 因素 水平 1 +1 F 值 PrF 重要性豆粕/X 1 % % 2菊粉/X 2 % % 6硫酸銨/X 4 % % 4初始 PH/X5 3磷酸二氫鉀/X 6 % % 7吐溫80/X 7 5氯化鈣/X 8 % % 1氯化鎂/X 9 % % 8表 35 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 35 BoxBenhnken design layout and experimental results通過 designexpert 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表 35 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菊粉酶活力(Y)對(duì)自變量豆粕添加量 X初始 pH 值 X氯化鈣添加量 X3 的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下：Y=+++表 36 響應(yīng)面方差分析表Table 36 Variance analysis for BoxBenhnken experimental results方差來源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 X2 1 **試驗(yàn)號(hào) X1 X2 X3 Y 酶活力/U1 1 1 0 2 1 1 0 3 1 1 0 4 1 1 0 5 1 0 1 6 1 0 1 7 1 0 1 8 1 0 1 9 0 1 1 10 0 1 1 11 0 1 1 12 0 1 1 13 0 0 0 14 0 0 0 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0 X3 1 **X12 1 *X1X2 1 X1X3 1 X22 1 **X2X3 1 X32 1 **模型 9 **失擬項(xiàng) 3 誤差 4 總和 16 注：*.差異顯著(P ＜) ；**.差異極顯著(P ＜)。在相同條件下，以加入失活的酶液的反應(yīng)液作對(duì)照。(6)擴(kuò)大培養(yǎng)將活化好的菌種轉(zhuǎn)接于 50mL 裝（250mL 三角瓶）的種子培養(yǎng)基中，28℃，180r/min搖床下培養(yǎng) 1d；(7)接種發(fā)酵按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的發(fā)酵條件，以 3%的接種量從種子培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接于 50mL 裝（250mL 三角瓶）的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵；(8)酶活力測(cè)定具體操作參考本論文 菊粉酶活力的測(cè)定方法； 研究?jī)?nèi)容 菌種分離取一定量冰箱中保藏的樣品，置于含無菌水和玻璃珠的三角瓶中，將樣品進(jìn)行充分振蕩分散后，涂布到以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng) 1d,選擇菌落分散程度適宜的平板，將對(duì)應(yīng)的稀釋度作為最適稀釋度，重復(fù)上述操作過程，以最適稀釋度進(jìn)行稀釋涂布，得到一定量的分離結(jié)果，待菌種篩選備用。有些微生物菊粉酶不宜用(NH) 2SO4 沉淀如 var 菊粉酶用(NH) 2SO4 沉淀易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷凍干燥 [14]。(2)氮源的影響在不同的培養(yǎng)條件下，對(duì)于不同菌株，氮源的影響也不同。產(chǎn)菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和細(xì)菌。20 世紀(jì) 70 年代后，各國(guó)開始以菊粉為原料，以酸法和酶法水解制備果糖。利用果糖或 UHFGS 替代蔗糖或果葡糖漿在食品工業(yè)上應(yīng)用，能避免由蔗糖、葡萄糖引起的齲齒、高血壓、糖尿病等副作用。關(guān)鍵詞：菊粉酶；高產(chǎn)菌株；發(fā)酵條件優(yōu)化AbstractIn the era of material abundance,people pay more attention to nutrition and health,inulinase as a Enzyme preparation which can degradate inulin to high purity fructose or lowmolecularweight fructos,it largescale production attract more and more attention by the research munity and the business present foreign study so much on microbial inulinase , including strains isolation, fermentation conditions and the nature of the enzyme, our studies on inulinase is still stuck in the laboratory stage, due to the low yield of enzyme and high production costs,it not yet industrialized application. Therefore, f