【正文】 展望由于時(shí)間及成本和設(shè)備問(wèn)題，本研究目前只停留在部分發(fā)酵條件即豆粕、菊粉、磷酸氫二鉀、(NH 4。因此，在試驗(yàn)時(shí)要定時(shí)用溫度計(jì)校正搖床的溫度。由于各個(gè)研究所使用的菌種不同且都是自己分離，純化的，菌種產(chǎn)地的不同，菌種在當(dāng)?shù)亟?jīng)過(guò)長(zhǎng)期的生長(zhǎng)繁殖適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐奶厥猸h(huán)境，而實(shí)驗(yàn)的菌種僅僅經(jīng)過(guò)短期的分離馴化，這很難改變菌種的性能，許多的特殊野生性狀未發(fā)生改變，這也是許多文獻(xiàn)的都對(duì)產(chǎn)菊粉酶菌株進(jìn)行分離及發(fā)酵條件研究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不同的原因。4 討論 本試驗(yàn)進(jìn)行了耐低溫菊粉酶產(chǎn)酶菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化研究，但在試驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題，本章將對(duì)這些問(wèn)題逐一進(jìn)行分析討論。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá) 。即在豆粕添加量 %，初始 pH ，氯化鈣添加量 %的條件下，以菊粉為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵的菊粉酶活力值最大，由回歸方程預(yù)測(cè)在此條件下的菊粉酶活力理論值為。=0=0=0解得 X1= ，X 2= ，X 3= 。由此可知，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，所以，可以利用該回歸方程來(lái)確定最佳提取工藝條件。由二次多項(xiàng)回歸模型方程得知，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯，回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)較大，而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說(shuō)明響應(yīng)面分析所選的 3 個(gè)因素之間的交互效應(yīng)較小。方程模型極顯著(P= ＜) ，說(shuō)明方程能夠很好的擬和試驗(yàn)結(jié)果。X9 1 X10 1 模型 10 *誤差項(xiàng) 1 總和 11 因素 水平 1 +1 F 值 PrF 重要性豆粕/X 1 % % 2菊粉/X 2 % % 6硫酸銨/X 4 % % 4初始 PH/X5 3磷酸二氫鉀/X 6 % % 7吐溫80/X 7 5氯化鈣/X 8 % % 1氯化鎂/X 9 % % 8表 35 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 35 BoxBenhnken design layout and experimental results通過(guò) designexpert 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表 35 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菊粉酶活力(Y)對(duì)自變量豆粕添加量 X初始 pH 值 X氯化鈣添加量 X3 的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下：Y=+++表 36 響應(yīng)面方差分析表Table 36 Variance analysis for BoxBenhnken experimental results方差來(lái)源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 X2 1 **試驗(yàn)號(hào) X1 X2 X3 Y 酶活力/U1 1 1 0 2 1 1 0 3 1 1 0 4 1 1 0 5 1 0 1 6 1 0 1 7 1 0 1 8 1 0 1 9 0 1 1 10 0 1 1 11 0 1 1 12 0 1 1 13 0 0 0 14 0 0 0 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0 X3 1 **X12 1 *X1X2 1 X1X3 1 X22 1 **X2X3 1 X32 1 **模型 9 **失擬項(xiàng) 3 誤差 4 總和 16 注：*.差異顯著(P ＜) ；**.差異極顯著(P ＜)。 (2)響應(yīng)面分析方案及結(jié)果對(duì)豆粕添加量(A) 、初始 pH(B)、氯化鈣添加量(C)作如下變化：X 1=(A3)/1，X 2=(B)/，X 3=()/，以 XX X 3 為自變量，以發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得的菊粉酶活性為響應(yīng)面值 Y，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表 10。表 33 PlackettBurman 試驗(yàn)方差分析6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 方差來(lái)源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 *X2 1 X3 1 X4 1 X5 1 *X6 1 X7 1 X8 1 *Table 33 Variance analysis for PlackettBurman experimental results注：*.差異顯著(P＜) ；**.差異極顯著(P＜)。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi) XX 5 和 X8 對(duì)菊粉酶活力均有顯著影響 (P＜)，其他因素在所考察的水平范圍內(nèi)對(duì)酶活力的影響不顯著。表 32 PlackettBurman 試驗(yàn)篩選主要影響因素Table 8 Variance analysis for PlackettBurman experimental results6 23 7 24 8 25 9 26 10 27 11 28 12 29 13 30 14 31 15 32 16 33 17 試驗(yàn)號(hào)X1 豆粕X2 菊粉/%X3 空白項(xiàng)X4 硫酸銨/%X5 初始pHX6 磷酸二氫鉀/%X7 吐溫80/%X8 氯化鈣/mMX9 空白項(xiàng)X10氯化鎂/mM酶活力/U1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 對(duì) PlackettBurman 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表 33 所示。針對(duì)初篩得到的 33 株菌株用 DNS 比色法進(jìn)行酶活力測(cè)定，得出結(jié)果如表 31 所示，結(jié)果表明 2 號(hào)菌株酶活力最高，為 。 圖 31 105 稀釋度下的菊粉酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)結(jié)果Figure 31 The separation training results of inulin enzyme source in bacteria in 105 dilution 菌種篩選 菌種初篩從上述分離得到的菌株中，挑取菌落形態(tài)不同且長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基平板中進(jìn)行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，得到 33 株菌株，如圖所示為初篩結(jié)果。菊粉酶活力定義為：以菊粉為底物，每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1μmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U) 。在相同條件下，以加入失活的酶液的反應(yīng)液作對(duì)照。(3)菊粉酶活力的測(cè)定方法發(fā)酵結(jié)束后，取 10mL 發(fā)酵液，6000r/min 離心 10min，取上清，制成粗酶液，4℃ 保存（如馬上能測(cè)就不用保存） 。計(jì)算后，得出果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=，R 2=，經(jīng)檢驗(yàn)顯著后，供菊粉酶活力測(cè)定用。表 24 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案Table 24 The response surface design scheme 菊粉酶活力的測(cè)定方法(1)主要試劑的配制 試劑的配制稱取酒石酸鉀鈉 ，溶于 500mL 蒸餾水中，加熱（不超過(guò) 50℃） ，于熱溶液中依次加入 3,5二硝基水楊酸 ，NaOH ，苯酚 ，無(wú)水亞硫酸鈉 ，攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至 1000mL，貯存于棕色瓶中，4℃低溫保存；依次加入藥品時(shí)，要一點(diǎn)點(diǎn)緩慢加入，溶一點(diǎn)加一點(diǎn)，不能顛倒順序；%菊粉溶液的配制取醋酸鈉 18g，加冰醋酸 ，加水稀釋成 1000mL 即得；得到的醋酸鈉溶液用 范圍的 pH 紙粗略的檢驗(yàn)其 pH 值即可；然后稱取 2g 菊粉溶于適量的上述醋酸鈉溶液中，由于菊粉在常溫下不易溶解，溶液呈白色渾濁狀，所以對(duì)其稍微加熱，并不斷攪拌加速其溶解，至溶液呈無(wú)色透明即可，將其轉(zhuǎn)至 100mL 容量瓶中，加醋酸鈉溶液至刻度值即得到 2%菊粉溶液。表 23 PlackettBurman 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 23 Factors level and coding in PlackettBurman test因素X1 豆粕/%X2 菊粉/%X3 空白項(xiàng)X4 硫酸銨/%X5 初始 pHX6 磷酸二氫鉀X7 吐溫80/%X8 氯化鈣/mMX9 空白項(xiàng)X10 氯化鎂/mM(2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù) BoxBenhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行三因素三水平兩次重復(fù)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的設(shè)計(jì)方案如表 5 所示。具體操作：將上述篩選出的高產(chǎn)菌株按照 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以 3%的接種量接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在三角瓶上對(duì)應(yīng)的標(biāo)上試驗(yàn)序號(hào)，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測(cè)酶活力。每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平“1 ”和高水平“1” ， “1”為“1”的 倍，另設(shè)兩個(gè)空白項(xiàng)對(duì)應(yīng)表中的 X3 和X9，以考察試驗(yàn)誤差。(2)菌種復(fù)篩以 3%的接種量將上述分離出的菌株分別接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的復(fù)篩（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基中，并相應(yīng)標(biāo)記，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測(cè)酶活力，比較篩選出酶活力最高的菌株；并將篩選出的高產(chǎn)菌株保藏于斜面培養(yǎng)基中。(6)擴(kuò)大培養(yǎng)將活化好的菌種轉(zhuǎn)接于 50mL 裝（250mL 三角瓶）的種子培養(yǎng)基中，28℃，180r/min搖床下培養(yǎng) 1d；(7)接種發(fā)酵按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的發(fā)酵條件，以 3%的接種量從種子培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接于 50mL 裝（250mL 三角瓶）的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵；(8)酶活力測(cè)定具體操作參考本論文 菊粉酶活力的測(cè)定方法； 研究?jī)?nèi)容 菌種分離