【正文】 。他無論在理論上還是在實(shí)踐中，都給與我很大的幫助，使我得到不少的提高這對(duì)于我以后的工作和學(xué)習(xí)都有一種巨大的幫助，感謝他耐心的輔導(dǎo)。是他們?cè)谖耶厴I(yè)的最后關(guān)頭給了我們巨大的幫助與鼓勵(lì)，給了我很多解決問題的思路，在此表示衷心的感激。 在我的十幾年求學(xué)歷程里，離不開父母的鼓勵(lì)和支持，是他們辛勤的勞作，無私的付出，為我創(chuàng)造良好的學(xué)習(xí)條件，我才能 順利完成完成學(xué)業(yè)，感激他們一直以來對(duì)我的撫養(yǎng)與培育。 學(xué)友情深，情同兄妹。 回首四年，取得了些許成績，生活中有快樂也有艱辛。 四年的大學(xué)生活就快走入尾聲，我們的校園生活就要?jiǎng)澤暇涮?hào)，心中是無盡的難舍與眷戀。 另外，我還要感謝大學(xué)四年和我一起走過的同學(xué)朋友對(duì)我的關(guān)心與支持，與他們一起學(xué)習(xí)、生活，讓我在大學(xué)期間生活的很充實(shí)，給我留下了很多難忘的回憶。再次對(duì)周巍老師表示衷心的感謝。郭謙功老師淵博的知識(shí)、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)和誨人不倦 的態(tài)度給我留下了深刻的印象。沒有他們的幫助，我將無法順利完成這次設(shè)計(jì)。經(jīng)過這次畢業(yè)設(shè)計(jì)，我的能力有了很大的提高，比如操作能力、分析問題的能力、合作精神、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)等方方面面都有很大的進(jìn)步。本次畢 業(yè)設(shè)計(jì)大概持續(xù)了半年，現(xiàn)在終于到結(jié)尾了。 （保密論文在解密后遵守此規(guī)定） 作者簽名 : 二〇 一 〇年 九 月 二十 日 22 致 謝 時(shí)間飛逝，大學(xué)的學(xué)習(xí)生活很快就要過去，在這四年的學(xué)習(xí)生活中，收獲了很多，而這些成績的取得是和一直關(guān)心幫助我的人分不開的。 作者簽名 : 二〇 一 〇年 九 月 二十 日 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）使用授權(quán)聲明 本人完全了解 濱州學(xué)院 關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的規(guī)定。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體均已在文中以明確方式標(biāo)明。 論文密級(jí)： □ 公開 □ 保密 （ ___年 __月至 __年 __月） (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 作者簽名： _______ 導(dǎo)師簽名： _______ _______年 _____月 _____日 _______年 _____月 _____日 21 獨(dú) 創(chuàng) 聲 明 本人鄭重聲明：所呈交的畢業(yè)設(shè)計(jì) (論 文 )，是本人在指導(dǎo)老師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果，成果不存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭議。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。盡我所知，除文中已經(jīng)特別注明引用的內(nèi)容和致謝的地方外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。 最后再一次感謝所有在畢業(yè)論文設(shè)計(jì)中曾經(jīng)幫助過我的老師和師姐，以及在論文中我引用和參考的文獻(xiàn)論著的作者。從課題的選擇直到試驗(yàn)的最終完成和論文的寫作，咸老師都始終給予我不懈的支持，在咸老師嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹笇?dǎo)下我的實(shí)驗(yàn) 操作能力有了顯著提高，對(duì)科學(xué)研究有了更深的認(rèn)識(shí)和感悟，在此謹(jǐn)向咸老師致以深深的敬意和誠摯的感謝。 某種 微生物表達(dá)的幾丁質(zhì)酶 18 酶學(xué)性質(zhì)如何，在何種情況下該幾丁質(zhì)酶能發(fā)揮更大的水解活性， 這 需要我們加強(qiáng) 幾丁質(zhì)酶酶學(xué)性質(zhì)的 研究，為 幾丁質(zhì)酶的應(yīng)用 提供 科學(xué)依據(jù) 。 而 幾丁質(zhì)酶 由于能 降解幾丁質(zhì) ， 轉(zhuǎn)化、產(chǎn)生菌體蛋白、氨基寡糖素等產(chǎn)物 ，在人類食品、醫(yī)藥、 化妝及動(dòng)物飼料等行業(yè)具有廣泛的開發(fā)前景 [18]。因此，今后應(yīng)加強(qiáng)微生物幾丁質(zhì)酶的系統(tǒng)研究，為幾丁質(zhì)酶研究及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。 本試驗(yàn)所研究的 GStachit1K 表達(dá)的幾丁質(zhì)酶 特異性降解膠體幾 丁質(zhì) 。 試驗(yàn)表明， SDS、尿素、 β 巰基乙醇 均 對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用。這可能是因?yàn)?金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶 的 影響因酶的來源不同而有差異 [16]，不同的酶發(fā)揮其活性所需的金屬離子不同。 相關(guān)資料顯示， Hg2+、 Pb2+、 Cu2+等重金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶有抑制作用，而 Mg2+、Ca2+ 、 Na+、 K+對(duì) 幾丁質(zhì) 酶有激活作用 [15]。 pH 穩(wěn)定性表明在 pH 之間幾丁質(zhì)酶有較高活性，說明幾丁質(zhì)酶在酸性 條件下 穩(wěn)定 。 而本試驗(yàn)研究的 酵母工程菌GStachit1K 產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度為 50 ℃ ， 最適 pH 值為 ，說明它與大多數(shù)微生物幾丁質(zhì)酶反應(yīng)所需條件 相近 。 產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是因?yàn)?微生物幾丁質(zhì)酶 的 來源不同 ，其酶的性質(zhì) 有 很大差異。 據(jù)報(bào)道， 粘質(zhì)沙雷氏菌 （ S. marcescens） 表達(dá)五種幾丁質(zhì)酶 ， 其分子量分別為 2 3 4 52 和 57KDa，而紅色鏈霉菌 （ S. erythraeus） 則僅產(chǎn)生一種 [12,13]， 分子量為 30KDa。因此，在 應(yīng)用 過程中應(yīng)避免 上述 金屬離子和 試劑的干擾 。 Fe2+、 Ba2+、 K+、 Na+對(duì)酶活性無明顯作用，而 Cu2+、 Ca2＋ 、 Mn2+、 Zn2+、 Ag+、 Mg2+、NH4+、 Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑制作用。在 溫度 35 ℃以下、 pH 之間，幾丁質(zhì)酶具有較高 的穩(wěn)定性 。 16 表 3 幾丁質(zhì)酶對(duì)不同底物的酶活 Tab. 3 Activities of chitinase on different matter 底物 酶活（ U/mL） 膠體幾丁質(zhì) 粉末幾丁質(zhì) 殼聚糖 3 結(jié)論與討論 結(jié)論 酵母 工程菌 GStachit1K 表達(dá)的幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 檢測證明，經(jīng)幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)表達(dá)和有效地分離純化，獲得了單一蛋白質(zhì)，其分子量約為 41KDa。 其中 ， 尿素破壞氫鍵使酶蛋白分子結(jié)構(gòu)松散，而β 巰基乙醇能使二硫鍵還原，破壞蛋白質(zhì)三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)，這些都使酶失活 。 15 0102030405060708090100H 2 O C u 2 + C a 2 + M n 2 + F e 2 + Z n 2 + B a 2 + K+ N a + A g + M g 2 + N H 4 + H g +不同金屬離子相對(duì)酶活（%） 圖 8 不同金屬離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響 Fig. 8 Effects of different metallicions on chitinase activity 變性劑 、 蛋白抑制劑 和有機(jī)溶劑 對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的影響 在酶的反應(yīng)體系中加入不同濃度的變性劑 、 蛋白酶抑制劑 和有機(jī)溶劑 后，對(duì)幾丁質(zhì)酶活性的作用如下表 2， SDS 的終濃度為 %、 1 % (w/v)都對(duì)酶有很強(qiáng)的抑制作用， 說明 SDS 能使幾丁質(zhì)酶蛋白分子間的氫鍵斷裂，使分子去折疊，破壞蛋 白分子結(jié)構(gòu)，使酶失活。 020406080100 pH相對(duì)酶活（%） 圖 7 幾丁質(zhì)酶的 pH 穩(wěn)定性 Fig. 7 The pH stability of chitinase 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響 金屬離子 對(duì) 酶活性 影響 如 圖 8 所示， Fe2+、 Ba2+、 K+、 Na+對(duì)酶活性無明顯作用，而 Cu2+、 Ca2＋ 、 Mn2+、 Zn2+、 Ag+、 Mg2+、 NH4+、 Hg2+對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑 制作用。 當(dāng) pH 超過 時(shí)酶活性 迅速 降低，在 pH 為 時(shí)，幾丁質(zhì)酶基本沒有活性。 0204060801003 . 0 3 . 5 4 . 0 4 . 5 5 . 0 5 . 5 6 . 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 8 . 0 8 . 5 9 . 0 9 . 5 1 0 . 0pH相對(duì)酶活（%） 圖 5 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適 pH Fig. 5 The optimum pH value of chitinase reaction 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果見圖 6，幾丁質(zhì)酶在 35 ℃ 以 下 是 比較穩(wěn)定 的 ， 50 ℃ 下 處理 1 h，殘余酶活為 12 %， 55 ℃ 處理 10 min 后 幾丁質(zhì)酶沒有活性。 13 02040608010030 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80T ( ℃)相對(duì)酶活（%） 圖 4 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 Fig. 4 The optimum temperature of chitinase reaction 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適 pH 值 幾丁質(zhì)酶的最適 pH 試驗(yàn) 結(jié)果如 圖 5， GStachit1K 菌株 幾丁質(zhì)酶在 pH 之間 都具有 較高的 活性，其中最適反應(yīng) pH 為 ，當(dāng) pH大于 時(shí)，酶活性 迅速 降低。 CK: the expression products of Pichia pastoris GS115 strain with pPIC9K vector 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 從圖 4中看出， GStachit1K 菌株表達(dá)的 幾丁質(zhì)酶在 3055 ℃ 條件下，都具有 較高的 活性，其最適反應(yīng)溫度為 50 ℃ 。 M: standard molecular weight proteins (low)。隨著時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸增加，57 天趨于穩(wěn)定，與測定的產(chǎn)酶曲線相一致。 1 2 3 4 5 6 7時(shí)間（d）酶活（U/ml）圖 2 酵母工程菌 GStachit1K 的產(chǎn)酶曲線 12 Fig. 2 The curve of activities to times for GStachit1K 幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 檢測 對(duì)純化酶液 [11]、酵母工程菌 17 天 的粗酶液進(jìn)行 SDSPAGE檢測， 以轉(zhuǎn) pPIC9K空載體的畢赤酵母 GS115 菌株的表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照。結(jié)果如圖 22， 隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，單位體積（ mL）的幾丁質(zhì)酶活性不斷增加， 57 天趨于穩(wěn)定 。 2 結(jié)果與分析 N乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 以 N乙酰氨基葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，在 540 nm 波長下測定 OD540值為縱坐標(biāo) ， 作出 標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 （ 圖 1 ）， 回歸 方 程為 y = – 。 變性劑 、 蛋白抑制劑 和有機(jī)溶劑 對(duì)酶活性的影響 在幾丁質(zhì)酶反應(yīng)體系中加入不同的變性劑 、 蛋白抑制劑 和 有機(jī)溶劑 ，使 SDS終濃度分別為 % 和 %(w/v)，尿素終濃度分別為 mol/L 和 mol/L，EDTA、 β 巰基乙醇終濃度為 1 mmol/L 和 10 mmol/L， Na2SO L半胱氨酸終濃度為 1 mmol/L 和 5 mmol/L，而甲醇、乙醇、異丙醇、丙三醇終濃度為 1 %和 5 %，在 50 ℃ 下反應(yīng) 1 h 后，以 反應(yīng)體系中 不加任何 試 劑的酶活 性 為 100 %，分別測定加入不同變性劑 、 蛋白抑制劑 和有機(jī)溶劑 后反應(yīng)體系中幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。將最高的酶活力定義為 100％，分別計(jì)算不 同 pH 值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。將最高的酶活力定義為 100％，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性。將最高的酶活力定義為 100 ％，分別計(jì)算不同 pH 值條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（方法同上）。最高的酶活力定義為 100％，分別計(jì)算不同溫度條件下幾丁質(zhì)酶的相對(duì)酶活性（即在不同溫度下 的酶活性占最高酶活性的百分比）。