【正文】 圖31 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后1106 cells/mL R. paludigenum在蘋果果實(shí)傷口處的生長動(dòng)態(tài)Fig. 31 Population dynamics of R. paludigenum in wounds of apples incubated at 25℃. Wounds were treated with 50ml of 1106cells/mL washed cell suspension of R. paludigenum alone. Bars represent standard errors of three replications. * Symbols indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。經(jīng)過幾丁質(zhì)（1%）誘導(dǎo)培養(yǎng)后，接種菌懸液濃度為1107 cells/mL時(shí)， R. paludigenum在蘋果果實(shí)傷口處的生長速度較未誘導(dǎo)組強(qiáng)，特別是在0~16 h內(nèi)，誘導(dǎo)組生長迅速，%。 結(jié)果. paludigenum在果實(shí)傷口處生長動(dòng)態(tài)的影響當(dāng)接種菌懸液濃度為1106 cells/mL時(shí)，在0~24 h內(nèi)，兩處理組的生長速率及菌體總量均無顯著性差異，但24 h后，幾丁質(zhì)處理組在生長速率及菌體總量方面顯著提高（圖31）。反應(yīng)從加入過氧化氫開始計(jì)時(shí)，連續(xù)測定在470 nm吸光度的降低值。取上清夜，置于冰水水浴，待用。稱取3 g果實(shí)組織加入5 mL冷(4℃)的50 mmol mmol l1 EDTA和1% PVPP PBS緩沖液(PH )。2個(gè)處理分別為：（1）50 μl無菌水；（2）50 μl 1108 cells/mL NYDB 培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)培養(yǎng)的R. paludigenum；處理后貯藏于常溫（20 ℃），并定期取樣對(duì)組織酶活活性進(jìn)行測定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次以上。每天定時(shí)對(duì)果實(shí)傷口處病害發(fā)生和發(fā)展情況進(jìn)行觀察和記錄，結(jié)果以平均病害發(fā)生率（%）和平均病斑直徑（mm）表示。l）的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 spores/ml。l）加入：（1）NYDB 培養(yǎng)基培養(yǎng)后經(jīng)過濾除菌的發(fā)酵上清液；（2）NYDB 培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)培養(yǎng)后經(jīng)過濾除菌的發(fā)酵上清液。. paludigenum發(fā)酵上清液的抑菌效果用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。病原菌接種處理后果實(shí)繼續(xù)貯藏在原先同樣條件下，5 d后對(duì)病害發(fā)生率（%）和病斑直徑（mm）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。處理后貯藏于常溫（2025℃）下貯藏，并用PE塑料膜密封作保濕處理。每個(gè)傷口處等量（50 181。. paludigenum對(duì)果實(shí)誘導(dǎo)抗性的影響參照de Capdeville等（2002）、Droby等（2002）和El Ghaouth等（2003）的方法進(jìn)行蘋果果實(shí)傷口系統(tǒng)抗性的誘導(dǎo)試驗(yàn)。每個(gè)處理重復(fù)3次，每重復(fù)12個(gè)果實(shí)。l無菌水反復(fù)清洗果實(shí)傷口處試樣組織三次， ml 離心管中，最后定容至1 ml。處理后貯藏在常溫（20℃）下，并定期取樣對(duì)酵母的群體數(shù)量進(jìn)行測定。l）的經(jīng)過幾丁質(zhì)培養(yǎng)后 R. paludigenum 的細(xì)胞懸浮液(1107 cells/mL、1106 cells/mL)。 果實(shí)選擇與預(yù)處理。 SWCJ1F超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司SIGMA 3K15離心機(jī) 德國希格瑪（SIGMA）公司QYC211全溫空氣搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司Sartrious電子天平 北京賽多利斯天平有限公司200 ml、1000 ml、5ml移液器 德國Eppendorf公司 血球計(jì)數(shù)板（2516） 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司LRH250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司（MDA）。本試驗(yàn)?zāi)康氖翘接懲ㄟ^在培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)等培養(yǎng)酵母R. paludigenum提高其拮抗效力的可行性，并對(duì)可能存在的相關(guān)機(jī)理，包括促進(jìn)酵母菌生長、分泌抗菌物質(zhì)和誘導(dǎo)抗性等進(jìn)行系統(tǒng)研究。最近的研究表明，酵母細(xì)胞壁的合成與酵母抗毒性化合物（Teixeira et al., 2006）和抗冷凍干燥（Ando et al., 2007）等逆境有關(guān)。一般認(rèn)為，酵母細(xì)胞壁主要是由β葡聚糖（約占細(xì)胞壁干重35%60%）和幾丁質(zhì)（%6%）等成分組成，其中幾丁質(zhì)的含量雖然相對(duì)較少，但可能在酵母細(xì)胞逆境和脅迫反應(yīng)中具有重要作用（Klis et al., 2006）。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，利用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)R. paludigenum酵母，以提高其生防效果是可行的，并且效果顯著，值得對(duì)其相關(guān)機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究分析。此外，聯(lián)合幾丁質(zhì)處理還能提高拮抗細(xì)菌Bacillus cereus、B. circulans、B. licheniformis、Serratia marcescen、Stenotrophomonas maltophilia和拮抗真菌Trichoderma harzianum對(duì)植物病原菌Bacillus cereus、Bipolaris sorokiniana、Fusarium oxysporum、Phaeoisariopsis personata、Phytophthora capsici、Rhizoctonia solani的拮抗效力（Zhang和Yuen, 1999；Ahmed等, 2003）。研究結(jié)果表明，無論是幾丁質(zhì)單獨(dú)誘導(dǎo)，NaCl單獨(dú)誘導(dǎo)，還是幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)，均能顯著提高R. paludigenum對(duì)梨和蘋果青霉病害的抑制效果，但是鹽誘導(dǎo)與幾丁質(zhì)誘導(dǎo)之間并無顯著的協(xié)同增效作用，且在蘋果果實(shí)上的結(jié)果暗示，幾丁質(zhì)對(duì)酵母生防的誘導(dǎo)效應(yīng)要比鹽誘導(dǎo)高。我們從海洋中篩選得到的Rhodosporidium paludigenum，是一株兼性海洋酵母，它能顯著抑制番茄、冬棗等多種果蔬的采后病害（Wang et al., 2008,2009）。海洋酵母是生活在海水中酵母的通稱，是酵母家族的一個(gè)生態(tài)類群，其生物學(xué)性質(zhì)和細(xì)胞的組成成分與陸生酵母基本相同。（3）經(jīng)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)36~48 h后，其生防效果達(dá)到最佳。s multiple range test.圖211 幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)R. paludigenum對(duì)蘋果青霉發(fā)病的影響Fig. 211 Severity of blue mold decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R. paludigenum cultured with chitin and NaCl. Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。s multiple range test.圖29 幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)R. paludigenum對(duì)梨青霉發(fā)病的影響Fig. 29 Severity of blue mold decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R. paludigenum cultured with chitin and NaCl. Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P )according to the Duncan39。這一結(jié)果暗示，在蘋果果實(shí)上，幾丁質(zhì)對(duì)酵母生防的誘導(dǎo)效應(yīng)要比鹽誘導(dǎo)高。在蘋果果實(shí)上，也得到了類似的結(jié)果(圖2圖211)。s multiple range test. 幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)對(duì)R. paludigenum生防效力的影響幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)后，R. paludigenum對(duì)梨青霉病的抑制效果顯著提高（圖28和圖29），特別是在處理后5 d前，無論是幾丁質(zhì)單獨(dú)誘導(dǎo)，NaCl單獨(dú)誘導(dǎo)，還是幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)，其發(fā)病率均低于25%，但是3個(gè)誘導(dǎo)處理組之間的生防效果均無顯著差異。在該培養(yǎng)時(shí)間條件下，幾丁質(zhì)對(duì)R. paludigenum生防效力的激發(fā)作用最為顯著。s multiple range test.但是隨著培養(yǎng)時(shí)間延長至48 h以上，% NYCB誘導(dǎo)培養(yǎng)的R. paludigenum生防活性逐漸下降，培養(yǎng)72和96 h后其拮抗效力低于NYDB中培養(yǎng)的酵母。s multiple range test. 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)R. paludigenum生防效力的影響%（w/v）的NYCB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)23472和96 h后，R. paludigenum對(duì)蘋果青霉病的抑制效果如圖26和圖27所示，%的幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，培養(yǎng)時(shí)間為2348 h的R. paludigenum其拮抗效力顯著增強(qiáng)，處理后第6天時(shí)，在NYDB中培養(yǎng)24 h的R. %，%的NYCB中培養(yǎng)236和48 h的R. %、%%，第7 d時(shí)，%的NYCB中培養(yǎng)36和48 h的酵母發(fā)病率分別比在NYDB中培養(yǎng)24 %%。字母代表不同顯著性（P ）。 106C: %幾丁質(zhì)NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（1106cell/ml）。 107C: %幾丁質(zhì)NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（1107cell/ml）。 108C: %幾丁質(zhì)NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（1108cell/ml）。Fig. 24 Efficacy of R. paludigenum at various concentrations (106, 107 and 10 8 cells/ml) after cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin（%）in inhibiting the disease incidence of Penicillium expansum in apple fruit wounds at 7th day. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。 106N: NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（1106cell/ml）。 107N: NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（1107cell/ml）。圖24 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度R. paludigenum酵母對(duì)蘋果青霉病第7天的抑制效果108N: NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（1108cell/ml）。 E: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin. Bars represent standard errors of three replications.. paludigenum酵母的生防效果試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母的生防效果隨著其濃度的增加而顯著增強(qiáng)。 C: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin。 E: %（w/v）幾丁質(zhì)NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum.Fig. 23 Incidence of blue mold decay caused by Penicillium expansum on apples inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. A: R. paludigenum cultured in NYDB。 C: %（w/v）幾丁質(zhì)NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum。 圖23 不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)后第5天R. paludigenum對(duì)蘋果青霉病的生防效果A: NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum。s multiple range tests.圖22 不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)后R. paludigenum對(duì)梨青霉病病斑直徑的影響Fig. 22 Severity of blue mold decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。同時(shí)，結(jié)合病斑直徑的情況，%的NYCB培養(yǎng)的R. paludigenum。第6天時(shí)，NYDB培養(yǎng)的R. %，%、%、%%幾丁質(zhì)后，%、%、%%。 數(shù)據(jù)處理分析與作圖采用SPSS軟件(Statistical Product and Service Solutions)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏差異分析方法（取p）。用PE塑料膜密封作保濕