【正文】 處理，并在室溫（20~25 ℃）下貯藏，每天定時(shí)記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（%）和病斑直徑（mm）表示。在試驗(yàn)果實(shí)的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為5 mm，深度為3 mm），每個(gè)傷口處分別加入50 μl下述液體（1）無菌水（作為對照）；（2）在NYDB中培養(yǎng)的R. paludigenum懸浮液（1108 cells/ml）；（3）%（w/v）的NYCB中培養(yǎng)的R. paludigenum 懸浮液（1108 cells/ml）；（4）%（w/v）NaCl的NYDB中培養(yǎng)的R. paludigenum懸浮液（1108 cells/ml）；（5）%（w/v）NaCl的NYCB（%，w/v）中培養(yǎng)的R. paludigenum懸浮液（1108 cells/ml）。每處理3個(gè)平行，每平行包括12個(gè)果實(shí)。2小時(shí)后，在每個(gè)傷口處加入30 μl的P. expansum孢子懸浮液，濃度為1104 cells/ml。 不同培養(yǎng)時(shí)間對幾丁質(zhì)誘導(dǎo)拮抗酵母生防活性的影響酵母活化和液體培養(yǎng)、%（w/v），二代液體培養(yǎng)時(shí)間分別為234796 h，所得酵母細(xì)胞懸浮液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后配制成所需濃度備用。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)12個(gè)果實(shí)。處理完畢后在常溫下（2025℃）貯藏，并用 PE 塑料膜密封作保濕處理。2 h后在每個(gè)傷口加入等量（30 181。每個(gè)傷口處等量（50 181。每處理3個(gè)平行，每平行包括12個(gè)果實(shí)。2 h后，在每個(gè)傷口處加入30 μl的P. expansum孢子懸浮液，濃度為1104 cells/ml。 幾丁質(zhì)對R. paludigenum生防效果的影響 不同濃度幾丁質(zhì)對拮抗酵母生防活性的影響酵母活化和液體培養(yǎng)、%、%、%%（w/v），二代液體培養(yǎng)時(shí)間為24 h，所得酵母細(xì)胞懸浮液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后配制成所需濃度備用。 果實(shí)選擇與預(yù)處理試驗(yàn)所用果實(shí)為正常商業(yè)成熟度的蘋果 (Malus domestica)果實(shí)，品種為紅富士；梨（Pyrus pyrifolia Nakai）果實(shí)，品種為水晶。 Feng and Zheng, 2007)。 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備 病原菌病原菌為擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum），購買自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，菌種在4℃下保存于PDA（去皮馬鈴薯200 g，加水煮沸20 min，過濾后在濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，定容至1000 ml蒸餾水中，121℃下滅菌20 min）斜面培養(yǎng)基中。菌種在4℃下保存于NYDA（葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，酵母粉5 g，瓊脂20 g，定容至1000 ml蒸餾水中，121℃下滅菌20 min）斜面培養(yǎng)基中。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 主要儀器TH3560全自動滅菌鍋 造鑫(TSAO HSIN)企業(yè)有限公司用R. paludigenum干粉制劑進(jìn)行了食品級小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，初步確定該制劑屬于實(shí)際無毒類。 本實(shí)驗(yàn)中所用到的生防酵母為，從中國東海近海海域中分離篩選到的一株對果蔬采后病害具有較好抑制效果的海洋酵母，經(jīng)英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心（CABI Bioscience Identification Services）鑒定為Rhodosporidium paludigenum Fell amp。幾丁質(zhì)（Chitin），又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動物的外殼與內(nèi)骨骼，節(jié)肢動物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物細(xì)胞壁中。近年來，果蔬采后病害生物防治的研究重點(diǎn)是酵母菌。為通過幾丁質(zhì)及其衍生物等酵母細(xì)胞壁組分誘導(dǎo)拮抗酵母，提高其拮抗效力建立理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)的順利實(shí)施，可為系統(tǒng)全面地提高拮抗酵母的生防活性提供一個(gè)新的有效途徑，促進(jìn)其進(jìn)一步邁向商業(yè)化推廣應(yīng)用。但是要實(shí)現(xiàn)拮抗酵母的商業(yè)化推廣應(yīng)用，迫切需要解決的問題是提高其生物學(xué)效力。研究幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后R. paludigenum對蘋果、梨采后主要真菌病害擴(kuò)展青霉（P. expansum）體內(nèi)的抑制效果，篩選出最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間，并結(jié)合其他誘導(dǎo)因子為蘋果、梨采后病害提供一種安全、經(jīng)濟(jì)有效的防治方法，并對可能存在的相關(guān)機(jī)理，包括促進(jìn)酵母菌生長、分泌抗菌物質(zhì)和誘導(dǎo)抗性等進(jìn)行系統(tǒng)研究。一是拮抗酵母單獨(dú)作用時(shí)，效果還無法與化學(xué)殺菌劑相比，二是采后貯藏是一個(gè)長期的過程，酵母制劑的生防效果和貨架壽命受到了采收、處理、包裝和銷售等多個(gè)環(huán)節(jié)諸多因素的影響（Janisiewicz et al., 2002；Spadaro et al., 2004）。而原有的兩種基于酵母的生防制劑Aspire TM（Ecogen，US）和YieldPlus（South Africa）已經(jīng)退出了生物保鮮劑的市場。 本課題研究目的近年來，采后生物保鮮劑的發(fā)展遇到了瓶頸。利用分子生物學(xué)和基因工程的手段研究拮抗菌的遺傳背景并開展相應(yīng)分子水平的改造是生物防治領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)化具有抑制病原真菌活性的蛋白和代謝產(chǎn)物也是提高拮抗酵母效力的重要途徑（Janisiewicz和Korsten，2002），但其前提是拮抗微生物遺傳背景的明確、轉(zhuǎn)化方法的建立和轉(zhuǎn)化目標(biāo)的確定等。阿根廷學(xué)者發(fā)現(xiàn)粘紅酵母（Rhodotorula glutini)產(chǎn)生的一種酸（rhodotorulic acid）能抑制許多病原真菌，而且發(fā)現(xiàn)整合使用rhodotorulic acid和該粘紅酵母能增強(qiáng)其對果實(shí)病害的控制（Calvente et al., 2001；Sansone et al., 2005）。等（1998）研究表明通過低水分活度培養(yǎng)Candida sake后其在采前使用時(shí)生長數(shù)量明顯增加并增強(qiáng)了酵母的拮抗效力，其機(jī)理與積累糖醇和海藻糖有關(guān)；Bonaterra 等（2005）報(bào)道在培養(yǎng)基中添加NaCl后能提高P. agglomerans EPS125在不同濕度貯藏條件下的生防效力，作用機(jī)制也與拮抗菌體內(nèi)海藻糖等物質(zhì)的積累有關(guān)。 采后拮抗菌對果實(shí)抗性的誘導(dǎo)及對抗性相關(guān)反應(yīng)的刺激果實(shí)拮抗菌備注蘋果出芽短梗霉C. saitoana刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和POD誘導(dǎo)抗性，并刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、b1,3葡聚糖酶分泌b1,3葡聚糖酶柚子柑橘C. oleophila誘導(dǎo)抗性，并刺激果實(shí)乙烯、PAL, 幾丁質(zhì)酶、b1,3葡聚糖酶、積累植保素等刺激果實(shí)硫還原蛋白基因表達(dá)刺激幾丁質(zhì)酶cDNA的表達(dá)刺激b1,3內(nèi)葡聚糖酶基因表達(dá)草莓出芽短梗霉誘導(dǎo)抗性櫻桃番茄膜醭畢赤酵母刺激果實(shí)POD，降低CAT和SOD，提高總蛋白，增強(qiáng)33和47kDa 蛋白刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、b1,3葡聚糖酶桃、梨、棗、蘋果羅倫隱球酵母誘導(dǎo)果實(shí)抗性；刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、b1,3葡聚糖酶、POD和PAL活性刺激果實(shí)b1，3葡聚糖酶基因表達(dá) 主要產(chǎn)抗生素菌株抗生素名稱產(chǎn)生菌株作用對象病原菌伊枯草菌素枯草芽孢桿菌B3核果類水果M. fructicola吡咯菌素洋蔥假單胞菌(P. cepacia) LT412W梨果、柑橘核果類水果擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢丁香霉素E丁香假單胞桿菌ESC10和ESC11（BioSave）檸檬吡喃酮木霉草莓、蘋果灰葡萄孢近年來，隨著拮抗菌和病原菌之間的細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)采后拮抗酵母的生理代謝機(jī)制可能是增強(qiáng)其拮抗能力的有效途徑之一（Janisiewicz和Korsten, 2002）。而且能在寄主上保持拮抗能力的細(xì)菌仍具有兩個(gè)弊病：首先，抗生素有可能誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性，從而逐步降低拮抗菌對病害的控制效果；其次，拮抗菌產(chǎn)生的抗生素對食用者也可能產(chǎn)生不利影響。 Janisiewicz et al., 1991）。生防菌作為激發(fā)子，具有生物可降解和性價(jià)比高等優(yōu)良特點(diǎn)，因此具有良好的應(yīng)用前景。已有的大量研究表明，多種生防菌，包括出芽短梗霉（A. pullulans）、C. saitoana、C. oleophila、膜醭畢赤酵母（P. membranefaciens）和羅倫隱球酵母（C. laurentii）等均能誘導(dǎo)多種果實(shí)的抗性及抗性相關(guān)反應(yīng)，提高果實(shí)自身抗性，減少采后腐爛（）（Filonow, 1999, 2001。這些胞外活性物質(zhì)可能參與了拮抗菌與病原菌之間的相互作用（）。這些吸附現(xiàn)象不能完全說明在拮抗菌與病原菌之間有重寄生作用，但可以肯定這種現(xiàn)象與拮抗菌的生理活動緊密聯(lián)系，因?yàn)榻?jīng)過熱殺死的拮抗菌不再有吸附現(xiàn)象發(fā)生。Arras（1996）用電鏡觀察到拮抗菌無名假絲酵母(C. famata)可以在病菌菌絲上定植，并促使菌絲裂解。但需要進(jìn)一步研究這些酶的來源及其在生物防治中的作用。出芽短梗霉（A. pullulans）能顯著抑制蘋果等水果采后多種病原菌，Castoria R和Ippolito A等（2001）在出芽短梗霉（A. pullulans）處理過的蘋果傷口上檢測到了濃度更高的β1,3葡聚糖酶和幾丁酶活性。許多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（幾丁酶，β1,3葡聚糖酶等），從而分解病原菌的細(xì)胞壁或菌絲體。這可能是一些酵母拮抗菌能在體外試驗(yàn)中抑制霉菌菌絲生長的原因之一。 ChandGoyal and Spotts, 1996）。這也反映了營養(yǎng)與空間的競爭可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要機(jī)理之一。已有的研究結(jié)果顯示，生防菌在果實(shí)傷口處接種越早，其對果蔬采后病原菌的抑制效果越好（ChandGoyal and Spotts, 1997。Janisiewicz等（1992）報(bào)道在蘋果等果實(shí)傷口處，糖類營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，而作為氮源的氨基酸等則相對貧乏，成為競爭的焦點(diǎn)，通過向蘋果傷口加入拮抗菌容易利用而病原菌難以利用的L天冬氨酸和L脯氨酸能顯著提高拮抗效果。在對E. herbicola B66和B90抑制蘋果青霉病和灰霉病的研究中發(fā)現(xiàn)，在稀釋的蘋果汁中，B66和B90能抑制灰葡萄孢和擴(kuò)展青霉分生孢子的萌發(fā)并溶解其萌發(fā)管（Sobiczewski et al, 1996），但在未稀釋的蘋果汁里這些反應(yīng)并不明顯，說明營養(yǎng)競爭在這里起到了非常重要的作用。拮抗菌與病原菌爭奪的營養(yǎng)物質(zhì)主要是碳水化合物、氮源等。生防通常是一個(gè)以上的機(jī)制共同作用的結(jié)果。它對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義，因此成為當(dāng)前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。目前已經(jīng)有4個(gè)基于拮抗微生物的生物防腐劑產(chǎn)品：Aspire（基于拮抗酵母Candida oleophila，美國），Yield Plus（基于拮抗酵母Cryptococcus albidus，南非），BioSave 10LP（基于拮抗細(xì)菌Pseudomonas syringae strain，美國）和Avogreen（基于拮抗細(xì)菌Bacillus subtilis，南非）（Janisiewicz和Korsten，2002；Fravel，2005）。例如在美國，（Prange et al., 2006）。目前，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，低溫貯藏鏈結(jié)合化學(xué)殺菌劑是比較成熟的商業(yè)采后處理技術(shù)。冷藏技術(shù)最大的局限性在于低溫只能抑制病原菌，不能根除，而且一些熱帶、亞熱帶果蔬果實(shí)在低溫下冷害情況嚴(yán)重（任紅等，2007）。近幾年來，低溫冷藏技術(shù)又有新的發(fā)展，采用臨界點(diǎn)低溫高濕存儲，℃～1℃和相對濕度為90％～98％的環(huán)境中存儲保鮮果蔬。低溫冷藏技術(shù)已經(jīng)在部分地區(qū)得到實(shí)際運(yùn)用，熱殺菌和輻照殺菌也是目前報(bào)道比較多的方法。因此，找到一種新的安全的可以替代化學(xué)殺菌劑，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意義。這一報(bào)道導(dǎo)致了幾種殺菌劑如克菌丹（Captan）和苯菌靈（Benomyl）等被美國環(huán)保機(jī)構(gòu)所禁用，并部分或全部的自動退出采后應(yīng)用市場。有許多研究報(bào)道，化學(xué)殺菌劑具有一定的毒副作用?；瘜W(xué)殺菌劑在全世界范圍廣泛使用，在歐洲和亞洲占農(nóng)藥市場的26%，但在美國只占6%。根據(jù)國內(nèi)外的研究報(bào)道，控制采后病害非殺菌劑的方法主要可分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法 3 大類。 果蔬采后病害的控制方法果蔬貯藏保鮮是果蔬生產(chǎn)減損、保值和增值的關(guān)鍵因素。lezCandelas, 2003）。 S225。植物在遭到病原菌侵染時(shí)，通過體內(nèi)木質(zhì)素和羥脯氨酸糖的沉積，植物抗菌素的積累，蛋白質(zhì)酶抑制劑和溶菌酶的合成來增強(qiáng)細(xì)胞壁的保衛(wèi)反應(yīng)。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物和微生物相互作用過程中具有重要作用（Torres et al., 2006)。lezCandelas, 1996；Akimitsu et al., 2004）。這些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染機(jī)制和過程，如滲透、組織泡軟、營養(yǎng)獲得、改變寄主生理等（S225。nchezTorres和Gonz225。 采后病原真菌的致病機(jī)理采后病原真菌具有眾多而且復(fù)雜的致病機(jī)理，但其最終目的都是成功的侵染寄主。病原菌孢子一旦接觸傷口組織，侵染就開始了（Janisiewicz和Korsten, 2002；Prusky和Lichter, 2007）。病原真菌不僅會造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可能引起嚴(yán)重的食品安全問題。病原真菌不僅會造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可能會引起嚴(yán)重的食品安全問題，如曲霉菌（主要是Aspergillums flavus和Aspergillums parasiticus等）產(chǎn)生的黃曲霉毒素、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）產(chǎn)生的棒曲霉素（patulin）等（Martins et al., 2002；Sholberg和Conway, 2004；DombrinkKurtzman和Blackburn, 2005；Brodhagen和Keller，2006；Morales et al., 2007）。據(jù)估計(jì)，僅美國每年由真菌性病害造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)330億美元（Maor和Shirasu, 2005；Strange和Scott, 200