【正文】 （ 4） 分子量測定 已知 標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)（低）各電泳條帶的分子量，通過電泳圖估計幾丁質(zhì)酶的分子量 [10]。 ③ 將凝膠置于 500 mL 脫色液中脫色， 至 膠脫 色完全。 （ 3）染色及脫色 ① 將電泳完畢的凝膠取出，用去離子水沖洗，然后放到考馬斯亮藍(lán) R250染色液中染色，過夜。混勻后在沸水中煮 10 min，冷卻后用微量加樣器將 25 μL 樣品和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分別注入加樣孔中。凝聚后小心拔出梳子，在玻璃 板兩側(cè)倒入電極緩沖液。 ② 將 3 % 濃縮膠凝膠液迅速注入分離膠上層，使液面與低板邊緣齊平，插入梳子。 9 （ 2）電泳操作 [9] ① 按照順序安裝玻璃板，然后沿兩板縫隙加入 15 % 融化的瓊脂，待瓊脂凝固后加入現(xiàn)配的 12 % 分離膠凝膠液，至膠面距低板邊緣 3 cm 左右，然后用滴管在膠面上輕輕鋪注 1 cm 水層，垂直放置膠板，室溫下放置 30 min 待膠凝聚。 （ 1）分離膠凝膠液與濃縮膠凝膠液的配制 ①12 % 分離膠凝膠液：取 mL 30 % 凝膠儲液， mL 分離膠緩沖液， mL 10 % SDS， mL ddH2O， 30 μl 10 % 過硫酸銨， 30 μl TEMED ，混勻。透析完全后，將透析液以 5000 r/min 離心 15 min，取上清液， 80℃ 保存。以 5000 r/min離心 15 min，收集沉淀。將發(fā)酵液 5000 r/min 離心 1015 min，收集上清液 即為粗酶液 。 幾丁質(zhì)酶的分離純化 粗酶液的制備 根據(jù)分析最佳收獲時間為 7 d。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 得出 還原糖的含量，然后計算酶活。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測定 將保存的 粗酶液樣品取出，幾丁質(zhì)酶活性測定參照 Antoni 和 Masarus 方法[6,7]， 并加以改進(jìn)。 ④ 測 540 nm 處的吸光值， 以蒸餾水為空白調(diào)零，每組 3 個重復(fù)。 8 ② 取 11 支 25 mL 按 (表 1)加入試劑，將各管混勻，沸水浴煮沸 10 min。樣品用于制作產(chǎn)酶曲線和蛋白電泳。 （ 5） 誘導(dǎo)開始后，每天取樣一次，直至第 7 天。 （ 3） 將培養(yǎng)液置于 500 mL 搖瓶中， 用 雙層 紗布封口，在搖床中 2830 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)表達(dá)（注意溫度不要超過 30 ℃ ）。 實驗方法 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá) （ 1）挑取 GStachit1K 單菌落，接種到含 25 mL BMGY 培養(yǎng)基的 250 mL搖瓶中，用紗布封口，放到搖床中， 28 ℃ 、 130 r/min 振蕩培養(yǎng) 3 d 至對數(shù)生長期（ OD600為 26）。 （ 6）廣泛 pH緩沖液 稱取 g 檸檬酸 、 g 磷酸二氫鉀 、 g 硼酸 、 g 巴比妥 ， 加 1 L 蒸餾水溶解。 7 ⑤ 停止加熱，冷卻至室溫，用水定容至 1000 mL 。 ③ 然后加入 91 g 酒石酸鉀鈉， g 苯酚和 g 無水亞硫酸鈉。 （ 5） DNS 的制備 ① 取 g DNS， 加 500 mL 水， 45 ℃ 水浴溶解。 ② 向溶液中加入 500 mL 50 % 乙醇，不斷攪拌至析出膠體，然后 5000 r/min離心 5 min，棄掉上清液。 ⑩ 脫色液：取 70 mL 冰醋酸， 200 mL 乙醇，加 1000 mL 蒸餾水。 ⑧ 固定液：取 45 mL 95%乙醇， 10 mL 冰醋酸，加 100 mL 蒸餾水。 ⑥ 樣品緩沖液：取 1 mL TrisHCl 緩沖液， g SDS， g 溴酚藍(lán)， 2 mL甘油， mL β 巰基乙醇，加 10 mL 蒸餾水溶解。 ④ 電極緩沖液：稱取 g SDS， 9 g Tris， g 甘氨酸，加 1500 mL蒸餾水溶解。 ② 分離膠緩沖液：稱取 g Tris， 48 mL 1 mol/L HCl，加 100 mL 蒸餾水溶解。 ②BMMY 培養(yǎng)基：稱取 5 g 酵母提取物， 10 g 蛋白胨，溶于 350 mL 蒸餾水中，高壓滅菌 20 min，然后冷卻至室溫，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、 50 mL 10M 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? ⑤10M （ 5 % Methanol，甲醇）：將 15 mL 甲醇與 285 mL 蒸餾水混合，過濾除菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? ③10GY （ 10 % Glycerol，甘油）：將 10 mL 甘油與 90 mL 蒸餾水混合，高壓滅菌 20 min 后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩? 培養(yǎng)基及有關(guān)溶液的配制 （ 1）培養(yǎng)基貯存液配制 ①10YNB （ % 酵母基本氮源，無氨基酸含硫酸銨）：將 g YNB溶于 400 mL 的蒸餾水中，過濾除菌后 4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?H 2O， CaCl2， MnCl2， FeSO4 1 材料與方法 實驗材料 供試菌株 酵母工程菌 GStachit1K、轉(zhuǎn) pPIC9K 空載體的畢赤酵母 GS115 菌株（未導(dǎo)入 幾丁質(zhì)酶 基因） 由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物實驗室提供。 畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，它克服了釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的諸多不足，成為國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的大量生產(chǎn)外源真核蛋白的較為理想的表達(dá)系統(tǒng)。 早期研究人員利用大腸桿菌來表達(dá)幾丁質(zhì)酶，但其表達(dá)率低且產(chǎn)生的酶多數(shù)不能分泌到胞外。 近年來，微生物幾丁質(zhì)酶的研究備受關(guān)注，但天然酶在生物體內(nèi)的含量 一般較低且容易受到底物和環(huán)境的影響，這對幾丁質(zhì)酶大量提取和制備造成了困難。而根據(jù)幾丁質(zhì)酶分泌性質(zhì)的不同， 又 可以將其分為胞外酶與胞內(nèi)酶 。 根據(jù)作用方式和酶解產(chǎn)物，幾丁質(zhì)酶可以分為：內(nèi)切幾丁質(zhì)酶（ endochitinase）、外切幾丁質(zhì)酶（ exochitinase）和幾丁二糖酶（ chitbiosidase）。因此幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究日益受到重視，前景 廣闊 。 此后 ， 人們又相繼從多種微生物 （ 包括細(xì)菌、放線菌、真菌 ）、 植物及動物中分離到幾丁質(zhì)酶 ， 4 并對幾丁質(zhì)酶的理化特性及生物學(xué)活性進(jìn)行了大量的研究。早在 1905年 Benecke就首次分離到了能利用幾丁質(zhì)作為營養(yǎng)物質(zhì)的微生物 ， 并定名為 Bacillus chitinovirous （ 溶幾丁質(zhì)芽孢桿菌） ， 但當(dāng)時并沒有關(guān)于幾丁質(zhì)酶活性方面的直接證據(jù) 。 溫和、高效、無污染的生物酶法 已 成為研究的熱點 [3]。 目前幾丁質(zhì) 生產(chǎn) 一般是采用化學(xué)方法降解， 這也 是工業(yè)化生產(chǎn) 中最早、最常用的方法。 細(xì)菌和真菌所分泌的幾丁質(zhì)酶可將幾丁質(zhì)中的 β 1,4 糖苷鍵水解，最終分解為 N乙酰β D葡萄糖胺。 國際醫(yī) 學(xué)營養(yǎng)食品學(xué)會將這種物質(zhì)定義為除糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)五大生命要素后的第六大生命要素，因此越來越受到廣泛關(guān)注。 Enzymatic Characterization 3 引言 幾丁質(zhì)（ chitin）又稱甲殼素、甲殼質(zhì)或幾丁聚糖，是 N乙酰 β D葡萄糖胺（ NAcetylβ DGlucosamine，簡稱 NAG）以 β 1,4 糖苷鍵聚合而形成的直鏈形大分子 ， 廣泛存在于自然界中， 主要來源于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟件動物的器官（例如烏賊的軟骨），以及 真菌 （ 如酵母、霉菌 ）的細(xì)胞壁中 ， 是除蛋白質(zhì)外地球上數(shù)量最大的含氮天然有機化合物。 Express。 本 研究結(jié)果 為 該酶的 研究和開發(fā) 利用 提供了 科學(xué)依據(jù)。結(jié)果表明 該酶 的最適 反應(yīng)溫度為 50 ℃ ， 在 35 ℃ 以下相對穩(wěn)定， 最適反應(yīng) pH值為 ， 在 pH 。 參考文獻(xiàn) ........................................... 錯誤 !未定義書簽。 展望 ........................................... 錯誤 !未定義書簽。 結(jié)論 ........................................... 錯誤 !未 定義書簽。 幾丁質(zhì)酶底物特異性測定 ........................ 錯誤 !未定義書簽。 不同金屬離子對酶活性的影響 ..................... 錯誤 !未定義書簽。 幾丁質(zhì)酶的熱穩(wěn)定性 ............................. 錯誤 !未定義書簽。 幾丁質(zhì)酶反應(yīng)的最適溫度 ......................... 錯誤 !未定義書簽。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測定 ....................... 錯誤 !未定義書簽。 2 結(jié)果與分析 ....................................... 錯誤 !未定義書簽。 幾丁質(zhì)酶的 SDSPAGE 檢測 ...................... 錯誤 !未定義書簽。 酵母工程菌產(chǎn)酶曲線的測定 ..................... 錯誤 !未定義書簽。 酵母工程菌的培養(yǎng)和幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)分泌表達(dá) ..... 錯誤 !未定義書簽。 主要儀器設(shè)備 ................................. 錯誤 !未定義書簽。 試劑 ......................................... 錯誤 !未定義書簽。 實驗材料 ....................................... 錯誤 !未定義書簽。 引言 ............................................... 錯誤 !未定義書簽。 作者簽名： 日期： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 日期： 年 月 日 指導(dǎo)教師評閱書 指導(dǎo)教師評價： 一、撰寫（設(shè)計）過程 學(xué)生在論文（設(shè)計）過程中的治學(xué)態(tài)度、工作精神 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生掌握專業(yè)知識、技能的扎實程度 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 學(xué)生綜合運用所學(xué)知識和專業(yè)技能分析和解決問題的能力 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 研究方法的科學(xué)性；技術(shù)線路的可行性；設(shè)計方案的合理性 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 完成畢業(yè)論文（設(shè)計）期間的出勤情況 □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 二、論文（設(shè)計）質(zhì)量 論文（設(shè)計）的整體結(jié)構(gòu)是否符合撰寫規(guī)范？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 是否完成指定的論文（設(shè)計）任務(wù)（包括裝訂及附件） ？ □ 優(yōu) □ 良 □ 中 □ 及格 □ 不及格 三、論文（設(shè)計）水平 論文（設(shè)計）的理論意義或?qū)鉀Q實際問題的指導(dǎo)意義 □ 優(yōu) □ 良 □