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β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化畢業(yè)論文-文庫(kù)吧資料

2024-09-09 16:23本頁(yè)面
  

【正文】 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 250 mL 的三角瓶中,于 37 ℃ 、 225 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng) 24 h 取樣測(cè)定 β半乳糖苷酶表達(dá)量,每個(gè)處理重復(fù) 3 次。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo); OD595為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)物線。以未接種的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為空白對(duì)照。 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 菌種生長(zhǎng)曲線測(cè)定 在篩選平板上挑一單菌落接種于裝液量 30 mL培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中,37℃ 、 225r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng),分別于 0、 1 1 2 3 4 60h取樣。 第 2 章 材料和方法 10 β半乳糖苷酶酶活力測(cè)定 取 粗酶液與 濃度為 mol/L 鄰硝基苯 βD半乳吡喃糖苷(ONPG)的 0. 05 mol/L 磷酸鈉緩沖液 (pH 值為 6. 5)混勻, 37 ℃ 反應(yīng) 10 min 后,加入 mL 濃度為 mol/L 的 Na2CO3終止液靜置 5 min,于 420 nm 比色測(cè)定生成鄰硝基苯酚 (ONP)濃度。 鄰硝基苯酚( ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線 用檸檬酸 Na2HPO4 緩沖溶液 ()配制 5mmol/ml 鄰硝基苯酚( ONP)。將培養(yǎng)好的菌液以 5000r/min 離心 10 min,棄掉上清液.沉淀經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后,在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎。 菌種生理生化鑒定 在細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,對(duì)所篩菌株進(jìn)行初步的生理生化鑒定 。搖床振蕩,使土壤顆粒被打散,混合均勻,用無(wú)菌水將上述溶液稀釋成 1010 10 106梯度,各取 200μL均勻涂布于乳糖篩選平板上, 35~ 40℃ 培養(yǎng)20~ 28 小時(shí)。 液體發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨 2%,酵母粉 %,乳糖 2%, %,蒸餾水 200ml,pH 自然 。近年來(lái),又報(bào)道了合成該酶的大分子底物,因此, β半乳糖苷酶不僅可用作超微量熒光酶聯(lián)分析,而且還可以在酶放大免疫測(cè)定( EMIT)和底物標(biāo)記熒光分析中進(jìn)行應(yīng)用( SLFIA)[13]。 β半乳糖苷酶在酶聯(lián)免疫反應(yīng) (EIA)中的應(yīng)用 β半乳糖苷酶經(jīng)戊二醛一步標(biāo)記抗人 IgG,建立了 ELISA 測(cè) 定程序,已用于人 IgG、人群破傷風(fēng)抗體、單克隆抗體檢測(cè),獲得滿意結(jié)果。 β半乳糖苷酶在制藥工業(yè)中的應(yīng)用 β半乳糖苷酶是酶類藥物,適用于嬰兒各種消化不良癥,如先天性乳糖酶缺乏癥、由胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉,由感冒及消化不良等引起的繼發(fā)性腹瀉。 分析食品中乳糖含量 將精制的 β半乳糖苷酶和其它酶 (如過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶 )聯(lián)合使用可以分析冰淇淋、干酪和含 牛乳的干制品中的乳糖含量。 生產(chǎn)低 聚半乳糖 (Galactooligosaccharide) 低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖為底物,經(jīng) β半乳糖苷酶催化作用而得到的。此外,用此水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等 [10]。世界年產(chǎn)量約為 9?107T,其中 50%當(dāng)廢水排放,不僅造成浪費(fèi),而且污染環(huán)境。 在酸乳制作中的應(yīng)用 用 β半乳 糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脫脂乳省時(shí)且節(jié)省蔗糖用量,而且能改善酸乳風(fēng)味和口感,延長(zhǎng)酸乳的貨價(jià)期。 防止乳制品冷凍時(shí)出現(xiàn)結(jié)晶 乳糖的溶解度較低,只有蔗糖的 10%,在制作冷凍乳制品時(shí)容易結(jié)晶析出,影響產(chǎn)品質(zhì)量。采用給患者同時(shí)服用 乳制品和 β半乳糖苷酶片 (通常是霉菌 β半乳糖苷酶 ,它的最適 pH 值與胃環(huán)境相一致 ),也可以解決這一問(wèn)題。但據(jù)有關(guān)資料報(bào)道,有 10%的白人, 51%的印第安人, 81%的非裔加勒人和 70%的亞洲人由于腸道內(nèi)缺乏 β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不適癥 (又稱乳糖不耐癥 )[7]。目前應(yīng)用較多的霉菌 β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉( Aspergillus oryzse)和黑曲霉( Aspergillus niger)。曲霉 β半乳糖苷酶的最適 pH 值較低,適用于 面 包 的制造以 及 分解面團(tuán)中的乳糖 , 有利于酵母發(fā)酵,并使制品具有良好的色澤。霉菌產(chǎn)生的 β半乳第 1 章 緒 論 5 糖苷酶較耐熱、耐酸,不需要活化劑和穩(wěn)定劑,穩(wěn)定性較高。脆壁酵母和乳酸酵母( Saccharimyces lactic)是生產(chǎn) β半乳糖苷酶的主要酵母菌種。但是,酵母菌容易培養(yǎng),在深層培養(yǎng)條件下可以大量生產(chǎn) β半乳糖苷酶,這些優(yōu)點(diǎn)掩蓋了它的不足,故酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶才得以成功的進(jìn)行開發(fā)。但因產(chǎn)量低及可能的毒性問(wèn)題,故迄今未用于工業(yè)化生產(chǎn)。 細(xì)菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 細(xì)菌 β半乳糖苷酶,尤其是嗜熱細(xì)菌產(chǎn)生 的酶正 得到廣泛的研究,到目前為止,大腸桿菌( Escherichia coli)產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶是研究的最徹底、最深入,并已大量用于生化分析中。目前僅來(lái)源于微生物的 β半乳糖苷酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值,利用微生物發(fā)酵法制取 β半乳糖苷酶,酶源豐富,產(chǎn)量高,生產(chǎn)成本低,周期短,而且不受季節(jié)、地 理位置等因素的影響。因此, β半乳糖苷酶具有廣闊的市場(chǎng)前景,并且會(huì)取得相當(dāng)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 隨著研究的不斷深入,微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的 β半乳糖苷酶活性會(huì)進(jìn)一步得到提高。工業(yè) 生產(chǎn) 上最直接、有效的方法就是將酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳,該法水解條件溫和( ~8,溫度 50~60℃ ),產(chǎn)物簡(jiǎn)單,不會(huì)破壞乳中的其他營(yíng)養(yǎng)成分。上海復(fù)旦大學(xué)的郭杰炎等以乳酸酵母 Y121發(fā)酵生產(chǎn)的 β半乳糖苷酶活力達(dá) 40u/ml( ONPG 單位),干燥制成的酶粉冰箱保藏半年,酶活殘存 98%。 1990年無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)的李強(qiáng)軍等選育到黑曲霉菌 CWL2NU3,經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)酶活 力達(dá) 12u/ml( ONPG 單位)。 國(guó)內(nèi)對(duì) β半乳糖苷酶的研究起步較晚,是在 20世紀(jì) 80年代以后開始的。 1972 年 Rlun 等報(bào)道了真菌 β半乳糖苷酶的特性。 1948 年 Caputto[2]等討論了通過(guò)大量培養(yǎng)和純化脆壁酵母( Saccharimyces fragilis)生產(chǎn) β半乳糖苷 酶的方法。 1889 年 ,荷蘭生物學(xué)家 Beijerincek 第一次報(bào)道了 β半乳糖苷酶可水解乳糖。 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 歷史上, β半乳糖苷酶的研究為微生物學(xué)的發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。 此外, β半乳糖苷酶可被加工成液態(tài)、藥劑或粉末狀形式的產(chǎn)品,用來(lái)治療乳糖不耐癥。 采用篩選出的菌種進(jìn)行酸奶加工,驗(yàn)證其加工性能,掌握其工藝加工性能和應(yīng)用于乳品加工的潛力,從而將其應(yīng)用于乳品發(fā)酵 產(chǎn)品,降低乳糖含量,緩解人體普遍存在的乳糖不耐癥,擴(kuò)大乳品的消費(fèi)量。乳酸菌定植于腸道內(nèi),它們?nèi)阅艽x被攝入人體內(nèi)的乳糖。 課題研究目的和意義 β半乳糖苷酶可以 有效降低乳制品中乳糖含量。因此解決乳糖不耐癥最好的辦法是將乳糖從食物中去除,以無(wú)乳糖配方的形式供給人體。 乳糖消化的程度取決于以下幾種因素:乳糖攝入量、在腸胃內(nèi)停留時(shí)間(由飲食時(shí)間決定)、 β半乳糖苷酶攝入量以及乳制品攝入量。此外,主要碳水化合物為乳糖的牛奶是一種全價(jià)營(yíng)養(yǎng)食東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 2 品,可以為人體提供蛋白質(zhì)、能量、鈣、磷和鉀等多種營(yíng)養(yǎng),促進(jìn)人體健康。未被消化的乳糖在滲 透壓的作用下進(jìn)入腸內(nèi)被其他細(xì)菌分解代謝,會(huì)生成乳酸以及其他有機(jī)酸,導(dǎo)致消化不良和胃腸不適。幾乎所有的哺乳動(dòng)物在斷奶后將失去分泌乳糖酶的能力,僅有極少數(shù)能在其腸道內(nèi)保持較高的乳糖酶活性。當(dāng)培養(yǎng)基中無(wú)誘導(dǎo)物質(zhì)時(shí),每一細(xì)胞中雖然沒(méi)有幾個(gè)分子的 β半乳糖苷酶 , 但一旦被誘導(dǎo),則每一世代都能合成多達(dá)幾千個(gè)分子的酶。 圖 1 乳糖水解機(jī)理 β半乳糖苷酶的分子 540kD, 為四聚體結(jié)構(gòu)。 ...................................11 第 3 章 β半乳糖苷酶 酶學(xué) 性質(zhì) ........................................................................................ 12 高產(chǎn) β半乳糖苷酶細(xì)菌的篩選 ........................................................................... 12 鄰硝基苯酚( ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線 ........................................................................... 12 菌株 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 ............................................................................................ 13 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 ....................................................................... 14 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 ........................................................................... 14 目 錄 IV pH 對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響 .............................................................................. 15 溫度對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響 ........................................................................... 16 不 同金屬離子及離子濃度對(duì) β半乳糖苷酶的影響 ................................................ 17 第 4 章 酶的固定化研究 ................................................................................................. 18 固定化酶簡(jiǎn)介 .................................................................................................... 18 酶的固定方法 ................................................................................................... 19 包埋法 .................................................................................................... 19 吸附法 .................................................................................................... 19 吸附法 .................................................................................................... 19 交聯(lián)法 ..................................................................................................... 19 固定化酶反應(yīng)器的類型 ..................................................................................... 20 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器 (Continuous Flow Stirred Tand Reactor, CSTR) ........ 20 固定床反應(yīng)器 (Packed Bed Reactor, PBR) .................................................. 21 流化床反應(yīng)器 (Fluidzed Bed Reactor, FBR) ................................................ 22 中空纖維反應(yīng)器 (Hollow Fiber Reactor) ...................................................... 22 固定化乳糖酶國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 ........................................................................... 23 國(guó)外研究進(jìn)展 .......................................................................................... 23 國(guó)內(nèi)研究進(jìn)展 .......................................................................................... 24 β半乳糖苷酶 的 固定 ........................................
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