【正文】 5 微紅，半透明，邊緣圓滑，菌落中等偏小 6 乳白色，半透明，邊緣圓滑，菌落較大 7 玫瑰紅色，不透明，邊緣 分枝狀 ，菌落中等偏小 8 淡黃色，半透明，邊緣圓滑，菌落中等偏小 從上表中可看出， 1 號菌株的酶活性最高，所以 選擇 1 號菌株作為實驗用菌株。 不同金屬離子及離子濃度對 β半乳糖苷酶的影響 將 β半乳糖苷酶與濃度為 mol/L 磷酸鈉緩沖液 (pH 值為 )混勻，并添加各種不同的金屬離子 (K+、 Na+、 Mg2+、 Mn2+、 Cu2+、 Fe2+、 Ca2+、 Zn2+和 Fe3+)，于 37℃ 測定酶活。緩沖液分別為醋酸鈉 (pH 值為 ，東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 11 ， )、磷酸鈉 (pH 值為 ， ， 和 )和 Tris—HCl(pH 值為 ， 和 )，相對酶活用百分比來表示。以培養(yǎng)時間為橫坐標； OD595為縱坐標繪制生長物線。 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 菌種生長曲線測定 在篩選平板上挑一單菌落接種于裝液量 30 mL培養(yǎng)基的 250 mL三角瓶中，37℃ 、 225r/min恒溫搖床培養(yǎng)，分別于 0、 1 1 2 3 4 60h取樣。 鄰硝基苯酚（ ONP）標準曲線 用檸檬酸 Na2HPO4 緩沖溶液 ()配制 5mmol/ml 鄰硝基苯酚（ ONP）。 菌種生理生化鑒定 在細菌形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，對所篩菌株進行初步的生理生化鑒定 。 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 2%，酵母粉 %，乳糖 2%， %，蒸餾水 200ml，pH 自然 。 β半乳糖苷酶在酶聯(lián)免疫反應(yīng) (EIA)中的應(yīng)用 β半乳糖苷酶經(jīng)戊二醛一步標記抗人 IgG，建立了 ELISA 測 定程序，已用于人 IgG、人群破傷風抗體、單克隆抗體檢測，獲得滿意結(jié)果。 分析食品中乳糖含量 將精制的 β半乳糖苷酶和其它酶 (如過氧化物酶、葡萄糖氧化酶 )聯(lián)合使用可以分析冰淇淋、干酪和含 牛乳的干制品中的乳糖含量。此外，用此水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等 [10]。 在酸乳制作中的應(yīng)用 用 β半乳 糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脫脂乳省時且節(jié)省蔗糖用量，而且能改善酸乳風味和口感，延長酸乳的貨價期。采用給患者同時服用 乳制品和 β半乳糖苷酶片 (通常是霉菌 β半乳糖苷酶 ，它的最適 pH 值與胃環(huán)境相一致 )，也可以解決這一問題。目前應(yīng)用較多的霉菌 β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉（ Aspergillus oryzse）和黑曲霉（ Aspergillus niger）。霉菌產(chǎn)生的 β半乳第 1 章 緒 論 5 糖苷酶較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高。但是，酵母菌容易培養(yǎng)，在深層培養(yǎng)條件下可以大量生產(chǎn) β半乳糖苷酶，這些優(yōu)點掩蓋了它的不足，故酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶才得以成功的進行開發(fā)。 細菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 細菌 β半乳糖苷酶，尤其是嗜熱細菌產(chǎn)生 的酶正 得到廣泛的研究，到目前為止，大腸桿菌（ Escherichia coli）產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶是研究的最徹底、最深入，并已大量用于生化分析中。因此， β半乳糖苷酶具有廣闊的市場前景，并且會取得相當可觀的經(jīng)濟效益和社會效益。工業(yè) 生產(chǎn) 上最直接、有效的方法就是將酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，該法水解條件溫和（ ~8，溫度 50~60℃ ），產(chǎn)物簡單，不會破壞乳中的其他營養(yǎng)成分。 1990年無錫輕工業(yè)大學(xué)的李強軍等選育到黑曲霉菌 CWL2NU3，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)酶活 力達 12u/ml（ ONPG 單位）。 1972 年 Rlun 等報道了真菌 β半乳糖苷酶的特性。 1889 年 ，荷蘭生物學(xué)家 Beijerincek 第一次報道了 β半乳糖苷酶可水解乳糖。 此外， β半乳糖苷酶可被加工成液態(tài)、藥劑或粉末狀形式的產(chǎn)品，用來治療乳糖不耐癥。乳酸菌定植于腸道內(nèi)，它們?nèi)阅艽x被攝入人體內(nèi)的乳糖。因此解決乳糖不耐癥最好的辦法是將乳糖從食物中去除，以無乳糖配方的形式供給人體。此外，主要碳水化合物為乳糖的牛奶是一種全價營養(yǎng)食東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文 2 品，可以為人體提供蛋白質(zhì)、能量、鈣、磷和鉀等多種營養(yǎng)，促進人體健康。幾乎所有的哺乳動物在斷奶后將失去分泌乳糖酶的能力，僅有極少數(shù)能在其腸道內(nèi)保持較高的乳糖酶活性。 圖 1 乳糖水解機理 β半乳糖苷酶的分子 540kD， 為四聚體結(jié)構(gòu)。 Mg2+ on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmol/L, the enzyme activity of up to %, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmol/L) can inactivate the enzyme. The experiments were also βgalactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by crosslink with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The results show that the high recovery rate of immobilized enzyme could be obtained under the conditions of % glutaraldegyde, 4% sodium alginate and 37℃ temperature. Keyword: βgalactosidase, enzymes activity, Immobilization of enzyme目 錄 III 目 錄 摘 要 .............................................................................................................................. I Absract .............................................................................................................................II 目 錄 ........................................................................................................................... III 第 1 章 緒論 .................................................................................................................... 1 研究背景 ............................................................................................................ 1 課題研究目的和意義 ........................................................................................... 2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 ................................................................................ 2 β半乳糖苷酶的來源及其特性 .............................................................................. 4 細菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 .......................................................................... 4 酵母菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 ....................................................................... 4 霉菌產(chǎn)生的 β半乳糖苷酶 .......................................................................... 4 β半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 ....................................................................... 5 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 ................................................................ 5 生產(chǎn)低聚半乳糖 (Galactooligosaccharide) ..................................................... 6 分析食品中乳糖含量 ................................................................................. 6 β半乳糖苷酶在制藥工業(yè)中的應(yīng)用 .............................................................. 7 β半乳糖苷酶在酶聯(lián)免疫反應(yīng) (EIA)中的應(yīng)用 ............................................... 7 第 2 章 材料和方法 .......................................................................................................... 8 材料 ................................................................................................................... 8 材料與試劑 ............................................................................................... 8 儀器與設(shè)備 ............................................................................................... 8 培養(yǎng)基 ...................................................................................................... 8 產(chǎn) β半乳糖苷酶菌的篩選 .................................................................................... 9 菌株篩選方法 ............................................................................................ 9 分離純化 ................................................................................................... 9 菌種生理生化鑒定 ..................................................................................... 9 β半乳糖苷酶粗酶液制備 ............................................................................ 9 鄰硝基苯酚（ ONP）標準曲線 ................................................................... 9 β半乳糖苷酶酶活 力 測定 .......................................................................... 10 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) ......