【正文】 t it is still a legal process and you will need to give evidence under an oath or affirmation. Most people find making a claim to an employment tribunal challenging. If you are thinking about making a claim to an employment tribunal, you should get help straight away from one of the anisations listed under Further help. ation about dismissal and unfair dismissal, see Dismissal. You can make a claim to an employment tribunal, even if you haven39。畢業(yè)論文定稿前尚潔老師每次修改都認(rèn)真負(fù)責(zé)，小到標(biāo)點(diǎn)符號(hào)的錯(cuò)誤，大到文章的整體布局和數(shù)據(jù)的處理，她都會(huì)提出需要改進(jìn)的地方。 尚潔老師平易近人，指導(dǎo)認(rèn)真負(fù)責(zé)，經(jīng)常在實(shí)驗(yàn)室親自指導(dǎo)我的實(shí)驗(yàn)，解答各種疑問 。Cu2+對(duì)漆酶有激活作用與 Cu2+是漆酶的一個(gè)活性中心 ， 也是漆酶分子的一個(gè)重要組成成分的特點(diǎn)一致。 1mM/L 時(shí)， fe3+的抑制作用最弱。隨著 pH 的波動(dòng)，酶活的衰減并不嚴(yán)重，所以 pH對(duì)漆酶酶活的影響系數(shù)不大。 對(duì)漆酶 pH的耐受和最適反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)反應(yīng)體系的 pH 為 3的 時(shí)候，漆酶的酶活最高。 C。 C的時(shí)候酶活最高，但時(shí)間久了酶活會(huì)逐漸喪失。 C 漆酶酶活喪失。 第 12 頁 共 14 頁 第 4 章 討論 白腐真菌木蹄層孔菌漆酶酶活的溫度和 pH 耐受實(shí)驗(yàn)表明，木蹄層孔菌產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)溫度為 20176。 此時(shí)酶活為 。 1mM/LEDTA對(duì)酶活有激活作用。 1mM/L 時(shí)， fe3+的抑制作用最弱。C 就基本失活。 因此可知該酶熱穩(wěn)定性較差，溫度低于 40176。處理 24h 時(shí)， 20176。C 酶活損失一半多， 50176。C 酶活力最高， 20176。 在相同pH 下，漆酶溫度的耐受性見圖 34。C 的時(shí)候，酶活最高 ， 故酶的反應(yīng)最 適 溫度為 50176。故在 pH 為 4 的時(shí)候，漆酶的酶活最穩(wěn)定 。 當(dāng) pH 低于 2 的時(shí)候，漆酶的 酶活 極低； 處理 1h 時(shí)， pH 為 和 4 時(shí)酶活都較 高 ， 處理 24h 后 酶活 仍能保持在 %~%。 第 8 頁 共 14 頁 第 3 章 結(jié)果與分析 最適反應(yīng) pH值及 pH 穩(wěn)定性 圖 31 體系 pH值對(duì)酶活力的影響 圖 32 酶的 pH穩(wěn)定性 在相同溫度下，漆酶 相對(duì) 酶活隨 pH 的變化如圖 31 所示 ， 漆酶的最適反應(yīng) pH 值為 3。已知 420 nm 處 ABTS摩爾消光系數(shù)ε 420= 104 L/(mol于 420nm處測(cè)定其吸光光度值，酶液最后加加完后立即 測(cè)定，測(cè)定漆酶與底物反應(yīng) 1min的吸光度 。 酶的活性單位式中， △ A／ min 為每分鐘吸光度（ A）凈增或凈減的數(shù)值； ε 為摩爾消光系數(shù)； mε為毫摩爾消光系數(shù)； TV為反應(yīng)液的總體積（ ml）； SV為樣品的體積（ ml）。 mε）（ TV247。 ε）（ TV247。做出 lac的酶促動(dòng)力學(xué)曲線， 計(jì)算酶活。 漆酶酶促動(dòng)力學(xué) Km即酶促反應(yīng)達(dá)到最大半反應(yīng)速率時(shí)的底物濃度。 C預(yù)熱 10min 后混合測(cè)酶活。 pH 耐受：將酶液分別和 pH 為 、 、 、 、 、 、 、 、 、ABTS、蒸餾水 30℃水浴 1h 后混合測(cè)酶活 ，共 9 個(gè)處理，每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，其中 、 、 三組設(shè)定 24h的對(duì)照 ，溫度為 4，測(cè)量三組酶活數(shù)據(jù)取平均值做曲線圖，找出木蹄層孔菌漆酶 pH 耐受的范圍。 其中 40 三組設(shè)定 24h 的對(duì)照 。 最適 酶活 溫度 ：將 酶和 pH的緩沖溶液、 ABTS、蒸餾水分別在 20℃、 30℃、 40℃、 50℃、 60℃、70℃、 80℃、 90℃、 100℃的溫度下 預(yù)熱 3min后混合測(cè)酶活 ， 共 9 個(gè)處理 ， 每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù) ， 取平均值做曲線圖 ， 找出木蹄層孔菌漆酶的 最適 酶活 溫度。 C， 12021r/min，離心 20min，棄沉淀，取上清液，此即為測(cè)酶活所用的粗酶液。在超凈工作臺(tái)上將活化好的菌種接到液體培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)液中用打孔器打入 3 個(gè)菌餅進(jìn)行培養(yǎng)，為測(cè)酶活做準(zhǔn)備。接菌完成后，用封口膜封好連接口，移入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度 設(shè)定為 28，在無光條件下培養(yǎng) 10 天，每天觀察菌的生長情況。去除掉蟲蛀和壞的，稱取 200g土豆料放入紗布中包好，再講紗布放入燒杯中，將燒杯置于沸水中煮 30min，拿出燒杯，將紗布擠干，再稱取葡萄糖 20g加入土豆湯中，用蒸餾水定容至 1L，加入適當(dāng)瓊脂（ 20g左右），用封口膜封口備用。 第 4 頁 共 14 頁 第 2 章 材料和方法 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 菌種 木蹄層孔菌（ 東北林業(yè)大學(xué)遺傳學(xué) 實(shí)驗(yàn)室提供） 實(shí)驗(yàn)材料、試劑 馬鈴薯、葡 萄糖、瓊脂、麥麩、玉米、木屑、可溶性淀粉、麥芽糖、酵母汁、 蛋白胨、牛肉膏 、ABTS(1mM)、檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液（ pH3）、 75%的酒精 . 表 21 微量溶液 的配制 藥品 含量 /L MgSo4 3g MnSo4 Nacl 1g Cacl2 CuSo4 Kal(So4) 10mg 10mg 次氮基三乙酸酯（ NTA） 表 22 液 體培養(yǎng)基 配制 藥品 含量 /L 白樺木屑 10g 酒石酸銨 KH2PO4 2g 第 5 頁 共 14 頁 MgSO4 CaCl2 琥珀酸（二）甲酯 10mM() 微量元素 70ml 硫胺素（ VB1） 1mg 紫外可見分光光度計(jì)、恒溫箱、烘箱、高壓濕熱滅菌鍋、干熱鼓風(fēng)超凈臺(tái)、可調(diào)控溫度搖床、冰箱、刀、鍋、電磁爐、打孔器、鑷子、三角瓶、燒杯、容量瓶、棕色試劑瓶、移液槍、離心管、高速冷凍離心機(jī)、離心機(jī)、磁力攪拌器、酸度計(jì)。在免疫檢測(cè)中，漆酶有望替代辣根過氧化物酶成為新的標(biāo)記酶，因?yàn)樗腥缦聨讉€(gè)優(yōu)點(diǎn)：氧氣作為第二底物，不形成非產(chǎn)物型的酶 底復(fù)合物；相比于過氧化物酶，漆酶對(duì)介質(zhì)中不同價(jià)態(tài)的金屬離子濃度的敏感性較低無需特殊的儀器和試劑。白腐菌漆酶具有廣泛的底物專一性，可以氧化芳香環(huán)化合物，對(duì)紡織染料的脫色及降解效果明顯。在底物聚合過程中，有氯離子從溶液中被釋放出來，這表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。利用這種方法培養(yǎng)木 耳、香菇等將有益于節(jié)約成本和擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模 [14]。另外， 漆酶還在食品分子的交聯(lián)、改善生面團(tuán)的性質(zhì)、增加醬油風(fēng)味、去除食品異味等工藝中發(fā)揮著重要作用。 目前 ， 漆酶介導(dǎo)系統(tǒng)己經(jīng)得到了實(shí)際應(yīng)用 [12]。 漆酶 還可用作 紙漿的生物漂白。 的應(yīng)用 造紙工藝中 需要去除木質(zhì)素 ， 傳統(tǒng) 高溫蒸煮去除木質(zhì)素的 紙漿得率低且污染環(huán)境 ， 而 漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解的這個(gè)特性可用于紙漿生產(chǎn)， 減少環(huán)境污染，杜絕廢水。 這類化合物結(jié)構(gòu)與酚類相似，比較容易被氧化 ； 羧酸及其衍生物：如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化 ； 一些人工合成的化合物：如 ABTS 等非酚類化合物也可以作為漆酶的底物 ； 金屬有機(jī)化合物 ： 這類底物 主要有二茂鐵類化合物 ； 其它化合物 :這類底物主要包括苯環(huán)上連有輕基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多環(huán)、稠環(huán)化合物、雜環(huán)化合物等。 漆酶的作用底物具有較大的廣譜性，初步統(tǒng)計(jì)，漆酶催化氧化不同類型的底物已達(dá) 250 個(gè)，而且還有增加的趨勢(shì)，底物結(jié)構(gòu)大致可歸納如下 [l2]：酚類及其衍生物 : 如 2， 6— 二甲氧基酚，愈創(chuàng)木酚等 。漆酶催化 4 個(gè)連續(xù)的單電子轉(zhuǎn)移氧化還原性底物，將分子氧還原為水。在 O2存在下，還原態(tài)漆酶被氧化， O2被還原為水。 漆酶 催化不同類型底物氧化反應(yīng)的機(jī) 理主要表現(xiàn)在兩方面：一方面是底物自由基中間體的生成。 就酚類化合物和芳香胺類化合物而言，漆酶利用氧分子作為電子受體，從被氧化的底物分子中，通過單電子提取方式從多酚類化合物的 o位和 p位的 OH和芳胺中去除一個(gè) H原子，形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，進(jìn)一步發(fā)生聚合或解聚反應(yīng)，引起重排 、 二聚 、 烷基 芳基斷裂 、 芐醇氧化 、 側(cè)鏈和芳環(huán)的斷裂或生成醌等一系列的非酶促反應(yīng) 。 漆酶理化性質(zhì) 漆酶的作用底物具有廣泛性，但對(duì)氧具有 專一性 。 由于漆酶底物的廣泛和人們對(duì)漆酶介質(zhì)的不斷研究，漆酶的商業(yè)用途也越來越廣泛。在產(chǎn)漆酶的真菌中最重要的是擔(dān)子菌中的白腐菌。在 ABTS 存在時(shí)，能氧化木質(zhì)素中的非酚型單元，并且其催化過程不需要 H2O2參與，因此它在催化木質(zhì)素降解時(shí)有一定的優(yōu)越性 [9]。研究表明其子實(shí)體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，其中的多糖具有抗腫瘤和免疫刺激活性。目前，對(duì)木蹄層孔菌的研究主要是對(duì)其甲醇、乙醇、乙酸乙 酯 、氯仿、石油醚、正丁醇的提取物的抗腫瘤活性進(jìn)行研究 [5]。在中國和亞洲其他許多國家，木蹄子實(shí)體水煎服廣泛用于治療食管癌、胃癌、口腔潰瘍、腸胃失調(diào)、發(fā)炎和各種感冒等疾病 [67]。分布于我國香港、廣東、廣西、云南、貴州、河南、陜西、四川 、湖南、湖北、山西、河北、內(nèi)蒙古、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江、西藏、新疆等地區(qū) [2]。 子實(shí)體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，代表物質(zhì)就是木蹄多糖 [ 4]。多呈灰色，灰褐、淺褐色至黑色，有一層厚的角質(zhì)皮殼及明顯環(huán)帶和環(huán)梭，邊緣鈍。木蹄層孔菌并不能食用，由于其 擔(dān)子果 可以 陰燃 幾個(gè)小時(shí)，故可以用來點(diǎn)火。它們生長在 北美洲 及 歐洲 的 樺木屬 及 水青 岡屬 。 C。 Enzyme activity stabilization are under 40 176。 關(guān)鍵詞 ： 木蹄層孔菌，漆酶，酶學(xué)性質(zhì) II ENZYMATIC PROPERTIES STUDY OF TINDER FUNGUS LACCASE ABSTRACT