【正文】 取一定量冰箱中保藏的樣品，置于含無菌水和玻璃珠的三角瓶中，將樣品進行充分振蕩分散后，涂布到以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng) 1d,選擇菌落分散程度適宜的平板，將對應的稀釋度作為最適稀釋度，重復上述操作過程，以最適稀釋度進行稀釋涂布，得到一定量的分離結(jié)果，待菌種篩選備用。室溫下靜置 510min，使菌液浸入培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng) 1d；(3)菌種初篩得到高產(chǎn)菌株是一項工作量浩大，獲得幾率低的工作，因此在得到最優(yōu)稀釋度后，要從不同樣品中進行大量的菌種分離操作，并從中挑取菌落形態(tài)不同且長勢較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基中進行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，初篩階段至少得到 30 株菌株并接種于斜面培養(yǎng)基中 4℃低溫保存，以待下一步復篩篩選高產(chǎn)菌株；(4)菌種復篩以 3%的接種量將上述分離出的菌株分別接種于 250mL 三角瓶（50ml 裝量）的復篩（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基中，并相應標記，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測酶活力，比較篩選出酶活力最高的菌株；并將篩選出的高產(chǎn)菌株接種于斜面培養(yǎng)基中 4℃低溫保存。7H2O %，K 2HPO4 %，菊粉 %，瓊脂 %， ；(3)初篩培養(yǎng)基：同分離培養(yǎng)基；(4)復篩培養(yǎng)基：(NH 4)2SO4 %，K 2HPO4 %，酵母膏 %，菊粉 %，pH ；(5)種子培養(yǎng)基：同復篩培養(yǎng)基配方 主要試劑表 21 主要試劑表Table 21 The Main reagent list藥品名稱 品級 制造商菊粉 食品級 廣州澤鈺生物科技有限公司豆粕 食品級 阜新維遠食品科技有限公司磷酸氫二鉀 分析純 沈陽市東興試劑廠硫酸鎂 分析純 沈陽市新西試劑廠硫酸銨 分析純 沈陽市新西試劑廠氯化鈣 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司氯化鉀 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司氯化鈉 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司氫氧化鈉 分析純 天津市大茂化學試劑廠無水硫酸鈉 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司苯酚 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司酒石酸鉀鈉 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司3,5二硝基水楊酸 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司冰醋酸 分析純 國藥集團藥業(yè)股份有限公司吐溫80 生化試劑 國藥集團藥業(yè)股份有限公司D果糖 生化試劑 國藥集團藥業(yè)股份有限公司 主要儀器設(shè)備表 22 主要儀器設(shè)備表Table 22 The main instrument equipment list酵母膏 生化試劑 國藥集團藥業(yè)股份有限公司蛋白胨 生化試劑 國藥集團藥業(yè)股份有限公司牛肉膏 生化試劑 國藥集團藥業(yè)股份有限公司瓊脂 生化試劑 國藥集團藥業(yè)股份有限公司名稱 型號 制造商精密 PH 計 PHS3C 型 上海精密科學儀器有限公司電子分析天平 FA2104N 上海精密科學儀器有限公司高速冷凍離心機 KDC160HR 上海精宏實驗設(shè)備有限公司振蕩培養(yǎng)箱 BS2F 上海精宏實驗設(shè)備有限公司恒溫培養(yǎng)箱 DNP9052 型 上海精宏實驗設(shè)備有限公司數(shù)顯鼓風干燥箱 GZX9070MBE 上海博迅實業(yè)有限公司超凈工作臺 SWCJ2F1D 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療 設(shè)備廠冰箱 BCD201Q 上海科隆電器紫外可見分光光度計 UV752 上海欣茂儀器有限公司恒溫水油浴鍋 MF5000 鞏義市予華儀器有限責任公 司電爐 JYC19BE2 山東九陽小家電有限公司電磁爐 JYC19BE2 山東九陽小家電有限公司 技術(shù)路線及操作要點 技術(shù)路線 圖 21 技術(shù)路線圖Figure 21 technology roadmap 操作要點(1)采樣菌源來自于實驗室一盆低溫保存的腐爛菊芋，采樣時要各個部位（垂直方向到水平方向）都采集到，至少做到垂直方向上中下三層，水平方向八個方位，以保證菌種采集充分，為下一步篩選高產(chǎn)菌株做準備；采集后的樣品于玻璃瓶內(nèi) 4℃冰箱低溫保藏（共 24瓶） 。因此本研究針對這一問題，對耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌進行高產(chǎn)菌株的分離，并針對分離菌種產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究，以期能夠得到低溫下即可分泌菊粉酶的高產(chǎn)菌株，實現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應用普及。外切酶的反應機理為單鏈反應，以菊粉為底物，以葡萄糖的生成速度、果糖與葡萄糖之比的變化速度為依據(jù)來判斷，水解反應一般為單鏈反應，即一次只水解一條鏈；pH對此作用機制有影響， 時，較多地傾向于多鏈反應， pH 時為單鏈反應 [18]。外切酶水解蔗糖的活力與轉(zhuǎn)化酶相同，內(nèi)切酶兒乎不水解蔗糖，Hg 2+、Ag +、Mn +強烈抑制酶活，說明酶活性中心有SH 基因， Ca2+使酶活增加，吲哚乙酸、EDTA ,磷酸毗哆醇對酶活沒有顯著影響 [9]。無花果曲霉() 菊粉酶經(jīng)純化得到三種酶 :外切酶 I、外切酶 II 和內(nèi)切酶 I，三種酶分子量分別為 42,900Da、43,400Da 、47,200Da 。 菊粉酶為糖蛋白，含糖量為 26%37%，低聚糖以糖苷鍵的形式與酶蛋白中的天門冬酰胺殘基相連，純化后的菊粉酶在 SDSPAGE 和活性電泳中表現(xiàn)出幾條譜帶是出于各組分含糖量不同所造成的，用 EndoH 去除酶蛋白中的糖后，在電泳中得到單一譜帶 [13]。有些微生物菊粉酶不宜用(NH) 2SO4 沉淀如 var 菊粉酶用(NH) 2SO4 沉淀易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷凍干燥 [14]。 菊粉酶的純化對于混合酶，酶的純化步驟一般分為:(NH) 2SO4 沉淀、離子交換層析及凝膠過濾色譜等。而 pH 時胞外無菊粉酶 [20]。Margaruttes 報道酵母有 25%的酶在胞外，75% 在胞壁和胞內(nèi) [11]。真菌達到最大生長量和最高酶活的溫度范圍為 2734℃，如黑曲霉(Aspergillus niger) 的最適產(chǎn)酶溫度為 30℃，青霉菌(Penici1lium )為 3033℃[12]。(5)溫度的影響克魯斯假絲酵母(Candidacrusei) 產(chǎn)酶的最適溫度為 2730℃，溫度提高將導致產(chǎn)酶量降低。(3)無機磷源的影響在培養(yǎng)基中加入磷源 NaH2PO4 %和 KH2PO4 %，產(chǎn)酶活力比不加磷源高 [6]。Kin 等人研究了各種無機氮源對青霉菌(Penicillium)產(chǎn)菊粉酶的影響，蛋白胨和玉米漿作氮源能提高產(chǎn)酶量，而脲和酵母膏影響不大 [22]。(2)氮源的影響在不同的培養(yǎng)條件下，對于不同菌株，氮源的影響也不同。Gupta 等人發(fā)現(xiàn)用從菊芋根中提取出來的果聚糖作碳源(開花前含很少量的葡萄糖和果糖)，比用菊粉作碳源，酶活力有很大提高 [9]。Fontana 等人用菊粉的衍生物己酸化菊粉和膽固醇菊粉作碳源，發(fā)現(xiàn)己酸化菊粉是最好的誘導物，其酶活比用菊粉作誘導物提高了 419816 倍 [10]。大多數(shù)的研究結(jié)果一致認為，以菊粉作為碳源比以其它糖作碳源產(chǎn)菊粉酶活力高，且不同碳源對野生菌株和誘變菌株的影響不同。Nakamura 等人對黑曲霉 (A .niger)進行 60Co 誘變得到誘變菌酶活 /mL，比野生菌提高了 4 倍；I/S 為 880，是野生菌的 16 倍 [9]。篩選出來的野生菌株往往酶活很低，且許多酵母和真菌合成菊粉酶的能力受到分解代謝物的抑制因此，須對野生菌株進行誘變，以篩選出產(chǎn)酶活高的菌株以 2脫氧 D葡萄糖作為篩子，因為它與葡萄糖結(jié)構(gòu)類似，且不能被微生物代謝利用，能夠在該培養(yǎng)基上生長的菌株為解除阻遏菌株。Nakamuar 等人詳細描述了篩選用的培養(yǎng)基及篩選過程，傳統(tǒng)的篩選培養(yǎng)基為：菊粉 %，K 2HPO4 %，MgS0 4`%，NaN0 3 %， (NH4)H2PO4 %，KCl %，F(xiàn)eSO4在這些微生物中黑曲霉(Aspergilliusniger)，無花果曲霉() ，不僅產(chǎn)外切酶和內(nèi)切酶，而且還產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶 [1,7]。產(chǎn)菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和細菌。利用菊粉酶直接發(fā)酵菊粉，制作功能性食品和飼料添加劑將有巨大的生產(chǎn)開發(fā)潛力。(4)其他方面應用菊粉酶還可直接發(fā)酵菊粉制備各種產(chǎn)品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高。國外有報道指出，用 （一種酵母菌株）或 (一種酵母菌株)發(fā)酵菊粉生產(chǎn)酒精，（一種黑曲霉菌株）轉(zhuǎn)化率為 90%以上(v/v)，后兩者幾乎能完全將菊粉發(fā)酵成酒精。工業(yè)上生產(chǎn)利用菊粉酶生產(chǎn)低聚果糖的方法是由內(nèi)切型菊粉酶水解菊粉而成，產(chǎn)物以低聚果糖為主，純度高，原料便宜，低聚果糖已被視為食品原料，而非食品添加劑 [10]。比利時 orafti 公司投資 20 億比利時法郎，歷時數(shù)十年種植菊藝開發(fā)生產(chǎn)低聚果糖和菊粉，分別作為食糖和油脂代用品 [21]。菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿的研究國內(nèi)外都較多，我國對其研究還處于起步狀態(tài) [9]。80 年代，美國、法國、比利時、加拿大等國的研究人員利用菊粉酶制果糖，其工藝簡單，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物純，果糖產(chǎn)量高，可直接生產(chǎn)超高果葡糖漿，果糖含量 90%以上 [17]。20 世紀 70 年代后，各國開始以菊粉為原料，以酸法和酶法水解制備果糖。研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的菊粉、麥芽糖和低濃度的果糖能夠誘導生成菊粉酶，淀粉對菊粉酶的影響不大，葡萄糖卻能明顯地抑制菊粉酶活性，這表明菊粉酶有底物專一性 [9]。提高菊粉酶酶解效率的關(guān)鍵在于提高酶活和增加底物對酶作用的敏感性。 菊粉酶的理化性質(zhì)(1)熱穩(wěn)定性：菊粉酶最適溫度在 5264℃之間，5558℃最適宜；(2)最適 pH：菊粉酶最適 pH 為弱酸性，這一性質(zhì)不僅操作安全，而且使用過程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩(wěn)定的 pH 值 [10]；(3)底物專一性：使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導產(chǎn)生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。外切菊粉酶在胞內(nèi)、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高純度果糖。一般認為外切菊粉酶的 I/s 值比內(nèi)切菊粉酶的 I/s 低。(2)根據(jù)作用底物方式的不同，或者說根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈方式分為內(nèi)切酶和外切酶。目前對菊粉酶的研究已引起了越來越多的學者的重視。利用果糖或 UHFGS 替代蔗糖或果葡糖漿在食品工業(yè)上應用，能避免由蔗糖、葡萄糖引起的齲齒、高血壓、糖尿病等副作用。 菊粉酶概述 菊粉酶的簡介菊粉酶(inulinase)是能夠水解 β2,1D果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學名 β2,1