【正文】 ble 35 BoxBenhnken design layout and experimental results通過(guò) designexpert 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表 35 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菊粉酶活力(Y)對(duì)自變量豆粕添加量 X初始 pH 值 X氯化鈣添加量 X3 的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下：Y=+++表 36 響應(yīng)面方差分析表Table 36 Variance analysis for BoxBenhnken experimental results方差來(lái)源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 X2 1 **試驗(yàn)號(hào) X1 X2 X3 Y 酶活力/U1 1 1 0 2 1 1 0 3 1 1 0 4 1 1 0 5 1 0 1 6 1 0 1 7 1 0 1 8 1 0 1 9 0 1 1 10 0 1 1 11 0 1 1 12 0 1 1 13 0 0 0 14 0 0 0 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0 X3 1 **X12 1 *X1X2 1 X1X3 1 X22 1 **X2X3 1 X32 1 **模型 9 **失擬項(xiàng) 3 誤差 4 總和 16 注：*.差異顯著(P ＜) ；**.差異極顯著(P ＜)。=0=0=0解得 X1= ，X 2= ，X 3= 。由于各個(gè)研究所使用的菌種不同且都是自己分離，純化的，菌種產(chǎn)地的不同，菌種在當(dāng)?shù)亟?jīng)過(guò)長(zhǎng)期的生長(zhǎng)繁殖適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐奶厥猸h(huán)境，而實(shí)驗(yàn)的菌種僅僅經(jīng)過(guò)短期的分離馴化，這很難改變菌種的性能，許多的特殊野生性狀未發(fā)生改變，這也是許多文獻(xiàn)的都對(duì)產(chǎn)菊粉酶菌株進(jìn)行分離及發(fā)酵條件研究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不同的原因。因此，在試驗(yàn)時(shí)要定時(shí)用溫度計(jì)校正搖床的溫度。即在豆粕添加量 %，初始 pH ，氯化鈣添加量 %的條件下，以菊粉為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵的菊粉酶活力值最大，由回歸方程預(yù)測(cè)在此條件下的菊粉酶活力理論值為。方程模型極顯著(P= ＜) ，說(shuō)明方程能夠很好的擬和試驗(yàn)結(jié)果。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi) XX 5 和 X8 對(duì)菊粉酶活力均有顯著影響 (P＜)，其他因素在所考察的水平范圍內(nèi)對(duì)酶活力的影響不顯著。菊粉酶活力定義為：以菊粉為底物，每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1μmol 還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U) 。表 24 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案Table 24 The response surface design scheme 菊粉酶活力的測(cè)定方法(1)主要試劑的配制 試劑的配制稱取酒石酸鉀鈉 ，溶于 500mL 蒸餾水中，加熱（不超過(guò) 50℃） ，于熱溶液中依次加入 3,5二硝基水楊酸 ，NaOH ，苯酚 ，無(wú)水亞硫酸鈉 ，攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至 1000mL，貯存于棕色瓶中，4℃低溫保存；依次加入藥品時(shí)，要一點(diǎn)點(diǎn)緩慢加入，溶一點(diǎn)加一點(diǎn)，不能顛倒順序；%菊粉溶液的配制取醋酸鈉 18g，加冰醋酸 ，加水稀釋成 1000mL 即得；得到的醋酸鈉溶液用 范圍的 pH 紙粗略的檢驗(yàn)其 pH 值即可；然后稱取 2g 菊粉溶于適量的上述醋酸鈉溶液中，由于菊粉在常溫下不易溶解，溶液呈白色渾濁狀，所以對(duì)其稍微加熱，并不斷攪拌加速其溶解，至溶液呈無(wú)色透明即可，將其轉(zhuǎn)至 100mL 容量瓶中，加醋酸鈉溶液至刻度值即得到 2%菊粉溶液。(2)菌種復(fù)篩以 3%的接種量將上述分離出的菌株分別接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的復(fù)篩（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基中，并相應(yīng)標(biāo)記，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測(cè)酶活力，比較篩選出酶活力最高的菌株；并將篩選出的高產(chǎn)菌株保藏于斜面培養(yǎng)基中。因此本研究針對(duì)這一問(wèn)題，對(duì)耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌進(jìn)行高產(chǎn)菌株的分離，并針對(duì)分離菌種產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，以期能夠得到低溫下即可分泌菊粉酶的高產(chǎn)菌株，實(shí)現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應(yīng)用普及。 菊粉酶為糖蛋白，含糖量為 26%37%，低聚糖以糖苷鍵的形式與酶蛋白中的天門冬酰胺殘基相連，純化后的菊粉酶在 SDSPAGE 和活性電泳中表現(xiàn)出幾條譜帶是出于各組分含糖量不同所造成的，用 EndoH 去除酶蛋白中的糖后，在電泳中得到單一譜帶 [13]。Margaruttes 報(bào)道酵母有 25%的酶在胞外，75% 在胞壁和胞內(nèi) [11]。Kin 等人研究了各種無(wú)機(jī)氮源對(duì)青霉菌(Penicillium)產(chǎn)菊粉酶的影響，蛋白胨和玉米漿作氮源能提高產(chǎn)酶量，而脲和酵母膏影響不大 [22]。大多數(shù)的研究結(jié)果一致認(rèn)為，以菊粉作為碳源比以其它糖作碳源產(chǎn)菊粉酶活力高，且不同碳源對(duì)野生菌株和誘變菌株的影響不同。在這些微生物中黑曲霉(Aspergilliusniger)，無(wú)花果曲霉() ，不僅產(chǎn)外切酶和內(nèi)切酶，而且還產(chǎn)轉(zhuǎn)化酶 [1,7]。國(guó)外有報(bào)道指出，用 （一種酵母菌株）或 (一種酵母菌株)發(fā)酵菊粉生產(chǎn)酒精，（一種黑曲霉菌株）轉(zhuǎn)化率為 90%以上(v/v)，后兩者幾乎能完全將菊粉發(fā)酵成酒精。80 年代，美國(guó)、法國(guó)、比利時(shí)、加拿大等國(guó)的研究人員利用菊粉酶制果糖，其工藝簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物純，果糖產(chǎn)量高，可直接生產(chǎn)超高果葡糖漿，果糖含量 90%以上 [17]。 菊粉酶的理化性質(zhì)(1)熱穩(wěn)定性：菊粉酶最適溫度在 5264℃之間，5558℃最適宜；(2)最適 pH：菊粉酶最適 pH 為弱酸性，這一性質(zhì)不僅操作安全，而且使用過(guò)程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩(wěn)定的 pH 值 [10]；(3)底物專一性：使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導(dǎo)產(chǎn)生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。目前對(duì)菊粉酶的研究已引起了越來(lái)越多的學(xué)者的重視。目前均停留于實(shí)驗(yàn)室階段，限制因子在于：產(chǎn)酶菌株菊粉酶產(chǎn)量低，產(chǎn)酶成本高。目前國(guó)外對(duì)微生物菊粉酶進(jìn)行了許多研究，包括菌種的篩選、產(chǎn)酶條件及酶的性質(zhì)的研究等，我國(guó)關(guān)于菊粉酶的研究目前還停滯在實(shí)驗(yàn)室階段，由于酶的產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高還未進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用,因此進(jìn)一步篩選性能優(yōu)良的高產(chǎn)酶菌株仍然十分重要。本文旨在從自然界選育產(chǎn)菊粉酶的微生物，并研究了產(chǎn)酶活力較高的一株細(xì)菌的最優(yōu)發(fā)酵條件，為實(shí)現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應(yīng)用普及打下基礎(chǔ)。通常用 I/s 的大小來(lái)區(qū)分內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I 是以菊粉作底物時(shí)的酶活，s 是以蔗糖作底物時(shí)的酶活。也就是說(shuō)，一定的底物可以誘導(dǎo)生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物對(duì)酶的活性影響很大。 (2)利用菊粉酶生產(chǎn)低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，有防治便秘、抑制腸內(nèi)腐敗物質(zhì)形成、提高機(jī)體免疫力、改善脂質(zhì)代謝、降低膽固醇等作用，同時(shí)適于糖尿病人食用 [9]。另外，嚴(yán)奉偉等已經(jīng)開始進(jìn)行菊粉軟糖的試制。 7H2O %，瓊脂 %，初始 pH [4]。這可能是山于己酸化菊粉不僅是更有效的誘導(dǎo)物，而且菊粉上的輕基被酷化后連接上的脂肪鏈有表而活性劑的作用，使得誘導(dǎo)物更易聚集在細(xì)胞壁上，從而改變了細(xì)胞壁的穿透能力，增加了對(duì)誘導(dǎo)物的吸收。(4)不同金屬離子和微量元素的影響Kim 和 Nakamura 等人發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加 FeS04， 4， 能使青霉菌(Penicillium )和黑曲霉() 的產(chǎn)酶量分別提高 32%，26%，12% [3]。對(duì)于馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus)以玉米漿和菊粉作培養(yǎng)基時(shí)，胞外酶最多，而以酵母膏和菊粉作培養(yǎng)基時(shí)胞內(nèi)酶最多，隨著培養(yǎng)溫度的提高胞外酶的比例下降胞壁酶和胞內(nèi)酶的比例上升 [9]。外切酶 I 和外切酶 II 以菊粉和蔗糖作為底物時(shí)，其最適反應(yīng)溫度分別為 60℃和 65℃,最適 pH 均為 ；降解菊粉所需最低活化能分別為 2211kJ/mol 和 3319kJ/mol；降解蔗糖所需要低活化能分別為 2217kJ/mol 和2815kJ/mol；內(nèi)切酶 I 降解菊粉所需最低活化能為 1mmol/L[16]。(2)菌種分離從保藏的樣品中適量挑取約 1g 放入盛 99mL 無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，震搖至少 20 分鐘，待其完全混合，細(xì)胞分散開后，用一支 1mL 無(wú)菌吸管從中吸取 1mL 樣品溶液加入事先準(zhǔn)備好的內(nèi)盛 9mL 無(wú)菌水的大試管中，充分混合；然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取 1mL 加入另一事先預(yù)備好的內(nèi)盛 9mL 無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 103,104,105,106,107,108 不同稀釋度的樣品稀釋液，通過(guò)初步菌種分離選出最適稀釋度；按分離培養(yǎng)基配方制作好三份平板，分別標(biāo)記 （每份平板準(zhǔn)備 3 個(gè)，即A1A2A3，B 1B2B3，C 1C2C3 共 9 個(gè)，下小標(biāo)表示三個(gè)最適稀釋濃度）倒置放置；A取上層醫(yī)用高壓蒸汽滅菌鍋 EST056 錦州科學(xué)儀器醫(yī)療設(shè)備廠樣品，B取中層樣品，C取下層樣品；用無(wú)菌吸管分別從上述 103 至 108 樣品稀釋液中各吸取 或 小心的滴于準(zhǔn)備好的平板培養(yǎng)基表面中央位置；用無(wú)菌涂布器涂布：右手拿無(wú)菌涂布器平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。評(píng)價(jià)指標(biāo)為菌株發(fā)酵后的酶活力 (U/mL)。果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖22。 圖 32 菊粉酶產(chǎn)生菌初篩結(jié)果Figure 32 The primary screen results of inulin enzyme source in bacteria 分別挑取初篩得到的菌株，接種于斜面保藏培養(yǎng)基中 4℃保藏。表 34 各因素的主要效應(yīng)表Table 34 main effect factors of the table 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(1)因素水平的選取選取豆粕添加量、初始 pH、CaCl 2 添加量三個(gè)在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)菊粉酶活性影響較顯著的三個(gè)因素，根據(jù) BoxBeknhen 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。從方差分析表還可以看出，方程的一次項(xiàng)極顯著，其中 XX 3項(xiàng)極顯著；方程的二次項(xiàng) X12 顯著，而 X2X 32 項(xiàng)極顯著；方程的交互項(xiàng)不顯著。為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的可靠性，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，選定豆粕添加量 %、初始 pH 值 、氯化鈣添加量 %，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò) 3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶實(shí)際酶活力的平均值為 ，與理論預(yù)測(cè)值 ，相對(duì)誤差為 %，說(shuō)明該回歸模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)