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耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件的優(yōu)化研究畢業(yè)論文-在線瀏覽

2024-08-02 18:14本頁面
  

【正文】 .........................................15 菌種分離 ..........................................................................................................15 菌種篩選 ..........................................................................................................15 菌種初篩 .......................................................................................................15 菌種復篩 .......................................................................................................16 發(fā)酵條件優(yōu)化研究 ..........................................................................................16 PlackettBurmen 試驗 ....................................................................................16 響應面優(yōu)化試驗 ...........................................................................................194 討 論 ......................................................................................................................225 結(jié)論 ......................................................................................................................24參考文獻 .................................................................................................................25致謝 .........................................................................................................................27附錄 A 譯文 ............................................................................................................28附錄 B 外文文獻 ....................................................................................................391 引言我國關(guān)于菊粉酶研究始于 90 年代,集中在菌株篩選和酶學性質(zhì)方而。生物學研究始于 90年代的工程菌還未構(gòu)造成功,關(guān)于菊粉酶分子至今具有生產(chǎn)意義。本文旨在從自然界選育產(chǎn)菊粉酶的微生物,并研究了產(chǎn)酶活力較高的一株細菌的最優(yōu)發(fā)酵條件,為實現(xiàn)菊粉酶的工業(yè)應用普及打下基礎。利用菊粉酶直接水解菊粉(或菊芋汁)生產(chǎn)果糖或超高果葡糖漿(UHFGS)己顯示出巨大的工業(yè)應用潛力,UHFGS 果糖含量為 90%95%,而目前普遍采用的利用淀粉生產(chǎn)的果葡糖漿僅含 42%45%的果糖,不僅轉(zhuǎn)化率低,而且工藝復雜。低聚果糖在消化道能促進雙岐桿菌的繁殖,從而抑制病原菌的活動。 菊粉酶的分類(1)根據(jù)菊粉酶在微生物體內(nèi)主要分布于細胞內(nèi)、細胞壁和細胞外,分別稱為胞內(nèi)酶、胞壁結(jié)合酶和胞外酶,比例主要受菌種、碳源、溫度和 pH 的影響:,另兩種酶比例上升;,前者胞外酶比例高于后者,其他兩種酶則相反;,細胞壁結(jié)合酶主要產(chǎn)自酵母; pH 使細胞壁通透性增大,提高了胸外酶比例,其他兩種酶比例下降。通常用 I/s 的大小來區(qū)分內(nèi)切型菊粉酶和外切型菊粉酶,I 是以菊粉作底物時的酶活,s 是以蔗糖作底物時的酶活。內(nèi)切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度低聚果糖,常由真菌分離出來。(3)根據(jù)來源不同可分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶。這可能是因為提取液除含菊粉外,還含有較多的短鏈的多聚果糖,更有利于菌體的生長以及被酶水解。也就是說,一定的底物可以誘導生成菊粉酶,但用不同的碳源作底物對酶的活性影響很大。 菊粉酶的生產(chǎn)應用(1)利用菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿高果糖漿價格低廉,味甜,爽口,滲透壓高,保藏效果好,熱值低,不易造成齲齒,而且糖尿病患者可利用,所以在美、日等發(fā)達國家被廣泛用于食品和醫(yī)藥工業(yè) [15]。酸法雖然產(chǎn)量高,但副產(chǎn)物多,色素重,分離精制難 [17]。外切菊粉酶降解產(chǎn)物以果糖為主且果糖比例高。 (2)利用菊粉酶生產(chǎn)低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維,有防治便秘、抑制腸內(nèi)腐敗物質(zhì)形成、提高機體免疫力、改善脂質(zhì)代謝、降低膽固醇等作用,同時適于糖尿病人食用 [9]。中國食品發(fā)酵研究所、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所等已經(jīng)試制成功,正在擴大試驗中。 (3)利用菊粉酶生產(chǎn)酒精利用菊粉酶生產(chǎn)酒精,國外相關(guān)研究較多。發(fā)酵粗菊芋提取液,不需加其他營養(yǎng)物質(zhì),25h 內(nèi)酒精產(chǎn)量 %[10]。另外,嚴奉偉等已經(jīng)開始進行菊粉軟糖的試制。 研究現(xiàn)狀 產(chǎn)菊粉酶的微生物菌種大多數(shù)微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶,并且常常呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶活力,轉(zhuǎn)化酶是一種水解蔗糖為葡萄糖和果糖的酶,對菊粉沒有作用。真菌類有黑曲霉(Aspergillus niger),無花果曲霉() ,米曲霉() ,盛泡曲霉(),青霉菌 (Penicillium),甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum),高大金孢(Chrysosporium pannorum)等 [19];酵母類有克魯維酵母(Kluyveromyces waltii),馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus) ,乳酸克魯維酵母 (),克魯斯假絲酵母(Candidacrusei)等 [23];細菌類有熒光假單胞菌(Pseudoumonas sp),丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)等。 產(chǎn)菊粉酶菌種的分離篩選產(chǎn)菊粉酶的菌種一般可以從菊芋或菊芋腐爛的根際土壤中的微生物利用以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基上分離篩選出來。 7H2O %,瓊脂 %,初始 pH [4]。Viswanathan 等人通過對黑曲霉(Aspergillus niger)進行紫外誘變,使菌體產(chǎn)酶活力提高 3 倍 [11]。 不同條件對微生物合成菊粉酶的影響(1)碳源的影響菊粉酶通常認為是一種誘導酶。Thonart研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘油、乙醇對經(jīng) NTG 誘變過的菌株有誘導作用,而對野生菌株無誘導作用 [9]。這可能是山于己酸化菊粉不僅是更有效的誘導物,而且菊粉上的輕基被酷化后連接上的脂肪鏈有表而活性劑的作用,使得誘導物更易聚集在細胞壁上,從而改變了細胞壁的穿透能力,增加了對誘導物的吸收。也有人認為菊粉酶是組成型酶,當馬克斯克魯維酵母()在以甘油作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長時也產(chǎn)菊粉酶。Gupta 等人研究了不同氮源對克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)產(chǎn)菊粉酶的影響,發(fā)現(xiàn)以蛋白胨作氮源時產(chǎn)菊粉酶活力最高 [7]。在無機氮源中,以(NH 4)2HPO4和(NH 4)H2PO4 作氮源產(chǎn)酶量最高,(NH 4)2SO4,NH 4C1,NH 4NO3 和 KNO3 也能促進產(chǎn)酶量提高 [6]。(4)不同金屬離子和微量元素的影響Kim 和 Nakamura 等人發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加 FeS04, 4, 能使青霉菌(Penicillium )和黑曲霉() 的產(chǎn)酶量分別提高 32%,26%,12% [3]。克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)產(chǎn)酶的最適溫度為 3040℃[21]。 菊粉酶的分布不同菌種菊粉酶的分布不一樣,Rottweatlioist 等人報道酵母有 50%酶在胞外。培養(yǎng)條件也影響菊粉酶的分布,對于克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)以 pH 影響最大,低 pH 高溫下有利于菊粉酶釋放于胞外,pH ,35℃下培養(yǎng)時,胞外有菊粉酶。對于馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus)以玉米漿和菊粉作培養(yǎng)基時,胞外酶最多,而以酵母膏和菊粉作培養(yǎng)基時胞內(nèi)酶最多,隨著培養(yǎng)溫度的提高胞外酶的比例下降胞壁酶和胞內(nèi)酶的比例上升 [9]。離子交換層析可用來選擇性地分離外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶,通常用 NaCl 進行線性梯度洗脫,隨著 NaCl 濃度增加,內(nèi)切菊粉酶先洗出,外切酶后洗出。Pessoa 等人研究了酵母胞外菊粉酶的純化,在離子色譜柱上,對于弱陰離子交換劑 DEAE,最佳吸附 pH 為 ,對于強陰離子交換劑,最佳吸附pH 為 [19]。 菊粉酶的性質(zhì)不同菌種所產(chǎn)菊粉酶的性質(zhì)有所不同。外切酶 I 和外切酶 II 以菊粉和蔗糖作為底物時,其最適反應溫度分別為 60℃和 65℃,最適 pH 均為 ;降解菊粉所需最低活化能分別為 2211kJ/mol 和 3319kJ/mol;降解蔗糖所需要低活化能分別為 2217kJ/mol 和2815kJ/mol;內(nèi)切酶 I 降解菊粉所需最低活化能為 1mmol/L[16]。黑曲霉() 內(nèi)切菊粉酶分子量 ,只水解菊粉不水解蔗糖,最適溫度為45℃, 40℃以下穩(wěn)定, 50℃以上開始失活,80℃時完全失活,最適 pH ,pH 時酶活為 100%pH 時酶活為 76%,pH 時酶活為 51%,pH 時酶完全失活 [5]。 研究的目的意義我國在菊粉酶研究和應用中的主要困難:產(chǎn)酶成本高,導致應用成本高。2 材料與方法 樣品 腐爛的菊芋,保藏于生化實驗室 4℃的冷柜中;
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