【正文】 .....................15 菌種篩選 ..........................................................................................................15 菌種初篩 .......................................................................................................15 菌種復篩 .......................................................................................................16 發(fā)酵條件優(yōu)化研究 ..........................................................................................16 PlackettBurmen 試驗 ....................................................................................16 響應面優(yōu)化試驗 ...........................................................................................194 討 論 ......................................................................................................................225 結論 ......................................................................................................................24參考文獻 .................................................................................................................25致謝 .........................................................................................................................27附錄 A 譯文 ............................................................................................................28附錄 B 外文文獻 ....................................................................................................391 引言我國關于菊粉酶研究始于 90 年代，集中在菌株篩選和酶學性質方而。目前均停留于實驗室階段，限制因子在于：產酶菌株菊粉酶產量低，產酶成本高。生物學研究始于 90年代的工程菌還未構造成功，關于菊粉酶分子至今具有生產意義。進一步篩選性能優(yōu)良的菊粉酶高產菌仍舊十分重要。本文旨在從自然界選育產菊粉酶的微生物，并研究了產酶活力較高的一株細菌的最優(yōu)發(fā)酵條件，為實現菊粉酶的工業(yè)應用普及打下基礎。 菊粉酶概述 菊粉酶的簡介菊粉酶(inulinase)是能夠水解 β2,1D果聚糖果糖苷鍵的一類水解酶，學名 β2,1D果聚糖酶，又叫 β果聚糖酶， β2,1D果聚糖水解酶，可以在一定的溫度條件下水解菊粉成果糖或低聚果糖 [10]。利用菊粉酶直接水解菊粉(或菊芋汁)生產果糖或超高果葡糖漿(UHFGS)己顯示出巨大的工業(yè)應用潛力，UHFGS 果糖含量為 90%95%，而目前普遍采用的利用淀粉生產的果葡糖漿僅含 42%45%的果糖，不僅轉化率低，而且工藝復雜。利用果糖或 UHFGS 替代蔗糖或果葡糖漿在食品工業(yè)上應用，能避免由蔗糖、葡萄糖引起的齲齒、高血壓、糖尿病等副作用。低聚果糖在消化道能促進雙岐桿菌的繁殖，從而抑制病原菌的活動。目前對菊粉酶的研究已引起了越來越多的學者的重視。 菊粉酶的分類(1)根據菊粉酶在微生物體內主要分布于細胞內、細胞壁和細胞外，分別稱為胞內酶、胞壁結合酶和胞外酶，比例主要受菌種、碳源、溫度和 pH 的影響：，另兩種酶比例上升；，前者胞外酶比例高于后者，其他兩種酶則相反；，細胞壁結合酶主要產自酵母； pH 使細胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他兩種酶比例下降。(2)根據作用底物方式的不同，或者說根據菊粉酶酶切果聚糖鏈方式分為內切酶和外切酶。通常用 I/s 的大小來區(qū)分內切型菊粉酶和外切型菊粉酶，I 是以菊粉作底物時的酶活，s 是以蔗糖作底物時的酶活。一般認為外切菊粉酶的 I/s 值比內切菊粉酶的 I/s 低。內切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度低聚果糖，常由真菌分離出來。外切菊粉酶在胞內、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高純度果糖。(3)根據來源不同可分為微生物菊粉酶和植物菊粉酶。 菊粉酶的理化性質(1)熱穩(wěn)定性：菊粉酶最適溫度在 5264℃之間，5558℃最適宜；(2)最適 pH：菊粉酶最適 pH 為弱酸性，這一性質不僅操作安全，而且使用過程中可以防止微生物污染，也是果糖最穩(wěn)定的 pH 值 [10]；(3)底物專一性：使用菊芋提取液或菊粉做碳源，都能誘導產生菊粉酶，但菊芋提取液作底物效果更好。這可能是因為提取液除含菊粉外，還含有較多的短鏈的多聚果糖，更有利于菌體的生長以及被酶水解。提高菊粉酶酶解效率的關鍵在于提高酶活和增加底物對酶作用的敏感性。也就是說，一定的底物可以誘導生成菊粉酶，但用不同的碳源作底物對酶的活性影響很大。研究發(fā)現一定濃度的菊粉、麥芽糖和低濃度的果糖能夠誘導生成菊粉酶，淀粉對菊粉酶的影響不大，葡萄糖卻能明顯地抑制菊粉酶活性，這表明菊粉酶有底物專一性 [9]。 菊粉酶的生產應用(1)利用菊粉酶生產高果糖漿高果糖漿價格低廉，味甜，爽口，滲透壓高，保藏效果好，熱值低，不易造成齲齒，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等發(fā)達國家被廣泛用于食品和醫(yī)藥工業(yè) [15]。20 世紀 70 年代后，各國開始以菊粉為原料，以酸法和酶法水解制備果糖。酸法雖然產量高，但副產物多，色素重，分離精制難 [17]。80 年代，美國、法國、比利時、加拿大等國的研究人員利用菊粉酶制果糖，其工藝簡單，轉化率高，產物純，果糖產量高，可直接生產超高果葡糖漿，果糖含量 90%以上 [17]。外切菊粉酶降解產物以果糖為主且果糖比例高。菊粉酶生產高果糖漿的研究國內外都較多，我國對其研究還處于起步狀態(tài) [9]。 (2)利用菊粉酶生產低聚果糖低聚果糖是一種良好的雙歧因子和水溶性膳食纖維，有防治便秘、抑制腸內腐敗物質形成、提高機體免疫力、改善脂質代謝、降低膽固醇等作用，同時適于糖尿病人食用 [9]。比利時 orafti 公司投資 20 億比利時法郎，歷時數十年種植菊藝開發(fā)生產低聚果糖和菊粉，分別作為食糖和油脂代用品 [21]。中國食品發(fā)酵研究所、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所等已經試制成功，正在擴大試驗中。工業(yè)上生產利用菊粉酶生產低聚果糖的方法是由內切型菊粉酶水解菊粉而成，產物以低聚果糖為主，純度高，原料便宜，低聚果糖已被視為食品原料，而非食品添加劑 [10]。 (3)利用菊粉酶生產酒精利用菊粉酶生產酒精，國外相關研究較多。國外有報道指出，用 （一種酵母菌株）或 (一種酵母菌株)發(fā)酵菊粉生產酒精，（一種黑曲霉菌株）轉化率為 90%以上(v/v)，后兩者幾乎能完全將菊粉發(fā)酵成酒精。發(fā)酵粗菊芋提取液，不需加其他營養(yǎng)物質，25h 內酒精產量 %[10]。(4)其他方面應用菊粉酶還可直接發(fā)酵菊粉制備各種產品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高。另外，嚴奉偉等已經開始進行菊粉軟糖的試制。利用菊粉酶直接發(fā)酵菊粉，制作功能性食品和飼料添加劑將有巨大的生產開發(fā)潛力。 研究現狀 產菊粉酶的微生物菌種大多數微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶，并且常常呈現出轉化酶活力，轉化酶是一種水解蔗糖為葡萄糖和果糖的酶，對菊粉沒有作用。產菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和細菌。真菌類有黑曲霉(Aspergillus niger)，無花果曲霉() ，米曲霉() ，盛泡曲霉()，青霉菌 (Penicillium)，甜瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)，高大金孢(Chrysosporium pannorum)等 [19]；酵母類有克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)，馬克斯克魯維酵母(K .Marxianus) ，乳酸克魯維酵母 ()，克魯斯假絲酵母(Candidacrusei)等 [23]；細菌類有熒光假單胞菌(Pseudoumonas sp)，丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)等。在這些微生物中黑曲霉(Aspergilliusniger)，無花果曲霉() ，不僅產外切酶和內切酶，而且還產轉化酶 [1,7]。 產菊粉酶菌種的分離篩選產菊粉酶的菌種一般可以從菊芋或菊芋腐爛的根際土壤中的微生物利用以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基上分離篩選出來。Nakamuar 等人詳細描述了篩選用的培養(yǎng)基及篩選過程，傳統(tǒng)的篩選培養(yǎng)基為：菊粉 %，K 2HPO4 %，MgS0 4`%，NaN0 3 %， (NH4)H2PO4 %，KCl %，FeSO4 7H2O %，瓊脂 %，初始 pH [4]。篩選出來的野生菌株往往酶活很低，且許多酵母和真菌合成菊粉酶的能力受到分解代謝物的抑制因此，須對野生菌株進行誘變，以篩選出產酶活高的菌株以 2脫氧 D葡萄糖作為篩子，因為它與葡萄糖結構類似，且不能被微生物代謝利用，能夠在該培養(yǎng)基上生長的菌株為解除阻遏菌株。Viswanathan 等人通過對黑曲霉(Aspergillus niger)進行紫外誘變，使菌體產酶活力提高 3 倍 [11]。Nakamura 等人對黑曲霉 (A .niger)進行 60Co 誘變得到誘變菌酶活 /mL，比野生菌