【正文】 urther screening of excellent performance, highyield enzyme strains are still very important.The study separation lowtemperatureresistant inulinase producing strains from the decayed artichoke kept at low temperature ,screening high yield inulin enzyme strains from the 33 strains by the method of DNS colorimetric,and the result show that 2nd strain enzyme is the highest yield Inulin enzyme ,enzyme activity lead to 。內(nèi)切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度低聚果糖，常由真菌分離出來(lái)。中國(guó)食品發(fā)酵研究所、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所等已經(jīng)試制成功，正在擴(kuò)大試驗(yàn)中。Viswanathan 等人通過(guò)對(duì)黑曲霉(Aspergillus niger)進(jìn)行紫外誘變，使菌體產(chǎn)酶活力提高 3 倍 [11]?？唆斁S酵母(Kluyveromyces waltii)產(chǎn)酶的最適溫度為 3040℃[21]。黑曲霉() 內(nèi)切菊粉酶分子量 ，只水解菊粉不水解蔗糖，最適溫度為45℃， 40℃以下穩(wěn)定， 50℃以上開(kāi)始失活，80℃時(shí)完全失活，最適 pH ，pH 時(shí)酶活為 100%pH 時(shí)酶活為 76%，pH 時(shí)酶活為 51%，pH 時(shí)酶完全失活 [5]。針對(duì)所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，得出相對(duì)應(yīng)的各個(gè)因素顯著性，由此確定哪些試驗(yàn)因素對(duì)于菊粉酶發(fā)酵過(guò)程起到主要影響作用，并對(duì)這些顯著影響因素的顯著性進(jìn)行排序。表 31 33 株菊粉酶產(chǎn)生菌菌株酶活力測(cè)定結(jié)果表Table 31 The enzyme activity determination result table of 33 strains inulin enzyme bacteria strains 菌株號(hào) 酶活力/U 菌株號(hào) 酶活力/U1 18 2 19 3 20 4 21 5 22 發(fā)酵條件優(yōu)化研究 PlackettBurman 試驗(yàn)選用 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)豆粕添加量、菊粉添加量、硫酸銨添加量、初始 pH 值、磷酸氫二鉀添加量、吐溫添加量、氯化鈣添加量、氯化鎂添加量 8 個(gè)影響菊粉酶活力的相關(guān)因素進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表 32。 圖 33 豆粕添加量和初始 pH 交互影響菊粉酶活性響應(yīng)面圖 Response surface graph of reciprocal effects of bean pulp and initial pH 圖 34 豆粕添加量和 CaCl2 添加量交互影響菊粉酶活性響應(yīng)面圖 Response surface graph of reciprocal effects of bean pulp and CaCl2 圖 35 初始 pH 和 CaCl2 添加量交互影響菊粉酶活性響應(yīng)面圖 Response surface graph of reciprocal effects of initial pH and CaCl2(3)最優(yōu)響應(yīng)值分析為確定各因素的最佳取值，根據(jù)回歸方程存在極值的必要條件，即 Y 分別對(duì)X1，X 2，X 3 求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為零，得出方程組，再解方程組即可。 進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)的影響因素本試驗(yàn)在進(jìn)行酶活力測(cè)定時(shí)需要用到恒溫水浴鍋來(lái)保持酶反應(yīng)的最適溫度 50℃，在進(jìn)行酶解反應(yīng)前，不能僅根據(jù)水浴鍋的數(shù)字顯示判斷其溫度已穩(wěn)定在 50℃，因?yàn)槠浼訜崦嬖阱伒撞浚瑴囟雀袘?yīng)板也在鍋底部，所以剛開(kāi)始加熱時(shí)其下層水的溫度必然要高于上層水的溫度，且板底部由于加熱的原因，必然溫度高于 50℃，因此需用溫度計(jì)測(cè)量其中部水溫，并待其一定時(shí)間內(nèi)（一般 3~5min）溫度保持穩(wěn)定后在進(jìn)行試驗(yàn)；并且由于反應(yīng)過(guò)程中，水浴鍋內(nèi)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水不斷蒸發(fā)散熱，使其溫度不能穩(wěn)定的維持在 50℃，所以，試驗(yàn)過(guò)程中要盡量密封開(kāi)口處，使散熱減少；酶解反應(yīng)的時(shí)間要做到統(tǒng)一 5min，最好一次將試驗(yàn)組全部做完，同時(shí)開(kāi)始反應(yīng)并同時(shí)結(jié)束，避免由于時(shí)間不統(tǒng)一而造成數(shù)據(jù)不科學(xué)，不可信；酶反應(yīng)階段結(jié)束后，要立即進(jìn)行沸水浴加熱滅火，避免酶對(duì)底物的后續(xù)反應(yīng)；在定容測(cè)吸光度值時(shí)，要迅速用冷水將混合液冷卻后再定，避免由于液體體積熱脹冷縮，造成定容不準(zhǔn)，影響吸光度值的準(zhǔn)確性。同時(shí)，軟件分析得到模型的決定系數(shù) R2=，說(shuō)明菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶活力所考察的 3 個(gè)因素中，僅有 %試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性不能由該模型來(lái)解釋，表明該模型能夠很好地反映試驗(yàn)的真實(shí)情況。計(jì)算公式： ?8Nx— 反應(yīng)液加入 蒸餾水后其果糖含量 (mg/mL)x4— 反應(yīng)液稀釋到 2mL，濃度變?yōu)樵瓉?lái)的 1/45—1mL 稀釋后的粗酶液加 2%的菊粉溶液，相當(dāng)于稀釋到 ，濃度變?yōu)樵瓉?lái)的 2/3N—粗酶液稀釋倍數(shù)180/1000—1mg 果糖的 μmol 數(shù)30—反應(yīng)時(shí)間 30min 圖 22 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 22 fructose standard curve3 結(jié)果與分析 菌種分離將采集到的樣品進(jìn)行菌種分離，得到最適稀釋度為 105，分離結(jié)果如圖 31 所示。 發(fā)酵條件優(yōu)化研究(1)PlackettBurmen 試驗(yàn)利用 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)從豆粕添加量、菊粉添加量、硫酸銨添加量、初始 pH 值、磷酸氫二鉀添加量、吐溫添加量、氯化鈣添加量、氯化鎂添加量這 8 個(gè)在發(fā)酵過(guò)程中影響菊粉酶活力的相關(guān)因素中，選出主要影響因素。 菊粉酶的性質(zhì)不同菌種所產(chǎn)菊粉酶的性質(zhì)有所不同。在無(wú)機(jī)氮源中，以(NH 4)2HPO4和（NH 4)H2PO4 作氮源產(chǎn)酶量最高，(NH 4)2SO4，NH 4C1，NH 4NO3 和 KNO3 也能促進(jìn)產(chǎn)酶量提高 [6]。 產(chǎn)菊粉酶菌種的分離篩選產(chǎn)菊粉酶的菌種一般可以從菊芋或菊芋腐爛的根際土壤中的微生物利用以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基上分離篩選出來(lái)。外切菊粉酶降解產(chǎn)物以果糖為主且果糖比例高。 菊粉酶的分類(1)根據(jù)菊粉酶在微生物體內(nèi)主要分布于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞壁和細(xì)胞外，分別稱為胞內(nèi)酶、胞壁結(jié)合酶和胞外酶，比例主要受菌種、碳源、溫度和 pH 的影響：，另兩種酶比例上升；，前者胞外酶比例高于后者，其他兩種酶則相反；，細(xì)胞壁結(jié)合酶主要產(chǎn)自酵母； pH 使細(xì)胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他兩種酶比例下降。：耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化研究外文題目：ISOLATION OF LOWTEMPERATURERESISTANT INULINASE PRODUCING STRAIN AND OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）共 50 頁(yè)（其中：外文文獻(xiàn)及譯文 23 頁(yè)）圖紙共 0 張 完成日期 2022 年６月 答辯日期 2022 年 6 月摘要在如今物質(zhì)豐富，人們注重營(yíng)養(yǎng)保健的年代，菊粉酶作為一種能將菊粉降解為高純度果糖或低聚果糖的酶制劑，其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)越來(lái)越受到科研界及商業(yè)界的重視。(2)根據(jù)作用底物方式的不同，或者說(shuō)根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈方式分為內(nèi)切酶和外切酶。菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿的研究國(guó)內(nèi)外都較多，我國(guó)對(duì)其研究還處于起步狀態(tài) [9]。Nakamuar 等人詳細(xì)描述了篩選用的培養(yǎng)基及篩選過(guò)程，傳統(tǒng)的篩選培養(yǎng)基為：菊粉 %，K 2HPO4 %，MgS0 4`%，NaN0 3 %， (NH4)H2PO4 %，KCl %，F(xiàn)eSO4(3)無(wú)機(jī)磷源的影響在培養(yǎng)基中加入磷源 NaH2PO4 %和 KH2PO4 %，產(chǎn)酶活力比不加磷源高 [6]。無(wú)花果曲霉() 菊粉酶經(jīng)純化得到三種酶 :外切酶 I、外切酶 II 和內(nèi)切酶 I，三種酶分子量分別為 42,900Da、43,400Da 、47,200Da 。每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平“1 ”和高水平“1” ， “1”為“1”的 倍，另設(shè)兩個(gè)空白項(xiàng)對(duì)應(yīng)表中的 X3 和X9，以考察試驗(yàn)誤差。 圖 31 105 稀釋度下的菊粉酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)結(jié)果Figure 31 The separation training results of inulin enzyme source in bacteria in 105 dilution 菌種篩選 菌種初篩從上述分離得到的菌株中，挑取菌落形態(tài)不同且長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基平板中進(jìn)行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，得到 33 株菌株，如圖所示為初篩結(jié)果。由二次多項(xiàng)回歸模型方程得知，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯，回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)較大，而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說(shuō)明響應(yīng)面分析所選的 3 個(gè)因素之間的交互效應(yīng)較小。 展望由于時(shí)間及成本和設(shè)備問(wèn)題，本研究目前只停留在部分發(fā)酵條件即豆粕、菊粉、磷酸氫二鉀、(NH 4。由此可知，各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，所以，可以利用該回歸方程來(lái)確定最佳提取工藝條件。針對(duì)初篩得到的 33 株菌株用 DNS 比色法進(jìn)行酶活力測(cè)定，得出結(jié)果如表 31 所示，結(jié)果表明 2 號(hào)菌株酶活力最高，為 。具體操作：將上述篩選出的高產(chǎn)菌株按照 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以 3%的接種量接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在三角瓶上對(duì)應(yīng)的標(biāo)上試驗(yàn)序號(hào)，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測(cè)酶活力。外切酶水解蔗糖的活力與轉(zhuǎn)化酶相同，內(nèi)切酶兒乎不水解蔗糖，Hg 2+、Ag +、Mn +強(qiáng)烈抑制酶活，說(shuō)明酶活性中心有SH 基因， Ca2+使酶活增加，吲哚乙酸、EDTA ,磷酸毗哆醇對(duì)酶活沒(méi)有顯著影響 [9]。(5)溫度的影響克魯斯假絲酵母(Candidacrusei) 產(chǎn)酶的最適溫度為 2730℃，溫度提高將導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。篩選出來(lái)的野生菌株往往酶活很低，且許多酵母和真菌合成菊粉酶的能力受到分解代謝物的抑制因此，須對(duì)野生