【正文】 基 (MM)； ? 在基本培養(yǎng)基中加入相應的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基 (SM)； ? 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基 (CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 、 麥芽汁培養(yǎng)基等 。 (二 )點種法 ? 也就是任意法 。 每個細胞中存在的質粒數(shù)稱為該質粒的拷貝數(shù) 。 11．在冰上放置 20min，在 37℃ 處理 2min。 ? 三、聚合酶鏈反應法擴增基因片段 ? 對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應（ＰＣＲ），以基因組 DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。 另一種方式是轉染 ， 即在 DNA連接酶作用下使噬菌體 DNA環(huán)化 ， 再象重組質粒一樣地轉化進受體菌 。 （ 二）酵母雜交育種技術 ? 酵母繁殖方式 ? 酵母為單細胞型真菌 ， 一般以出芽方式生殖 ， 在通常情況下 ， 繁殖體為雙倍體 ， 但經過特定條件的誘導 ，可使其產生單倍體孢子并可出芽產生單倍體繁殖體 。 (七 )有助于建立工業(yè)微生物轉化體系 。 3 ． 酶濃度 對于不同種屬的微生物 ， 不僅對酶的種類要求不同 ， 就是對酶的濃度也有差異 。 ? 鑒別可分為兩方面： 一是對微生物方面進行形態(tài) 、 培養(yǎng) 、 生化功能答試驗觀察 ， 并確定微生物產生菌的類群； ? 二是從化學的早期鑒別來鑒別微生物的代謝產物 。 一次性篩選法 噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。 ?通過冷凍 ， 使微生物代謝活動停止 。 三、液氮冷凍保藏技術 (一 )冷凍保護劑 在液氮冷凍保藏中 ， 最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油 ， 最終使用濃度一般為甘油 10％ 、二甲亞砜 5％ 。 4． 取下安瓿上的棉塞 ， 然后用 lml移液管分裝安瓿(／瓿 )， 重新塞好棉塞 。 然后將此轉接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中 ， 或直接接種瓊脂斜面或涂布平板 。 為了預防不測 ， 一般保藏株 2～ 3年也應做一次存活試驗 。 ? 成功的菌種長期保藏方法之有價值的指標包括在保藏 6個月 、 1年或更長時間后存活百分率 (或存活單位 )。 ?浸沒保藏的操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長 ， 然后注入經 170℃ 下滅菌 12h的礦物油 ，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物 1cm為宜 。 (三 )凍干菌種的保藏與再生 1． 保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于 5℃ 下保藏 。 當冷凝器的溫度達到 40℃ 時啟動真空泵 ， 使真空度達到 ～ 。 ?在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： ? 1． 離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞； ? 2． 用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞； ? 3． 加入等體積的 20％ 甘油或 10％ 二甲亞砜； ? 4． 混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中 ， 于 70℃ 超低溫冰箱中保藏 。 一、理想的菌種保藏方法應具備的條件 (1) 經長期保藏后菌種存活健在； (2) 保證高產突變株不改變表型和基因型 ， 特別是不改變初級代謝產物和次級代謝產物生產的高產能力 。 特殊變異菌的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應先進行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。 ? 在預篩選時 ， 多用瓊脂平扳擴散抑菌法 。 在放線菌和細菌中 ， 制備原生質體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等 。 (三 )遺傳物質傳遞更為完整：原生質體融合是二親株的細胞質和細胞核進行類似的合二為一的過程 。 重組 DNA的鑒定 遺傳學方法 雜交育種 (一 )細菌雜交 ? 在細菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多 ， 主要是大腸桿菌 ，其他還有鼠傷寒沙門氏菌 、 銅綠假單胞菌 、 淋病奈氏球菌等 。 轉化時 ， 細菌必須經過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)－即容易接受外源 DNA的狀態(tài) ， 然后利用短暫熱休克使 DNA導入細菌宿主中 。 目的基因的獲取 ? 一、通過建立基因文庫分離靶基因 ? 基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內切酶。 6．取 10 ml培養(yǎng)物置 2個冷離心管中棄去上清液。 在 5～ 6個平皿上可測 20株菌以上 。 (一 )影印法 ? 4 ． 將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng) 。 4．死亡率計算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。 2． 將菌懸液放入一巳滅菌的 ， 裝有玻璃珠的三角瓶內用手搖動 ， 以打散菌體 。 (四 )中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前 ， 有一個表現(xiàn)延遲的過程 ， 即細胞內原有酶量的稀釋過程 (生理延遲 )， 需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來 。 誘變劑的選擇 1． 堿基類似物和羥胺具有很高的特異性 ， 但很少使用 ，回復突變率高 ， 效果不大 。 提高特定基因的表達水平 ? (1)引入強轉錄及翻譯信號 ， 可通過在一高效表達載體上克隆靶基因；在靶基因的上游引入強啟動子；修改現(xiàn)有表達信號 ， 提高基因效力等 。 嗜酸微生物在酸性環(huán)境中，細胞膜可以阻止 H＋ 進入胞內、不斷將 胞內 H＋ 排出胞外。 （ 2）作用：作為代謝、生理等研究的好材料和發(fā)酵生產中用作種子的最佳菌齡。 ? 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài) 、 從而初步地加以鑒定 ， 在分離放線菌時顯得尤為重要 。 ? 選擇性地添加抗生素 。 ? 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設備與之配合。 ? 青霉素抗 G+菌有效，對 G菌作用很弱，對人的副作用小，有過敏反應。 從已知的抗生素進行結構改造，經篩選獲得新的半合成抗生素。 采樣的對象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 （ 1）前體物質 某些化合物加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中結合到產物的分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但產物的量卻因加入而有較大的提高。 ? 生長曲線的不同時期反映的是 群體 而不是單個細胞的 生長規(guī)律。 環(huán)境因素對微生物生長的影響 一、溫度 溫度太低：使原生質膜處于凝固狀態(tài)，不能正常進行 營養(yǎng)物質的運輸或形成質子梯度。 工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟 ，由此提供一個旁路代謝途徑 。 ? 其他的幾種射線都是電離性質的 ， 有一定的穿透力 ， 一般都由專業(yè)人員在專門的設備中使用 ，否則有一定危險性 。 3． 每次誘變處理都有一定提高的菌株 ， 往往多次誘變能積累較多的提高 。 在以后的復篩階段 ， 還應不斷結合自然分離 ， 純化菌株 。 亞硝基胍誘變曲霉菌 ? N— 甲基 — N39。 由于細菌或酵母對一些抗生素敏感 ， 于是就相應加入一定量的抗生素 ， 結果活化狀態(tài)的野生型就被殺死 ， 保存了缺陷型 。 ? 此法缺點是 ， 結果有時不明確 ， 而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易 。在實驗室條件下，質粒也可經人工手段將其轉化入宿主細胞內。 常用的遺傳轉化系統(tǒng) ? 自然系統(tǒng) ? 人工誘導（完整細胞） （ 1）二價陽離子系統(tǒng)： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+，Ca2++輔助噬菌體， Tris+Ca 2+ （ 2）單價陽離子系統(tǒng)： PEG+Li+/Cs+/Rb+ （ 3）凍融系統(tǒng) （ 4） Triton處理：人工誘導（ PEG/原生質體） 重組 DNA中常用的工具酶 ? 包括限制性核酸內切酶 、 DNA連接酶 、DNA聚合酶 、 逆轉錄酶等 。 DNA連接是由 DNA連接酶催化完成的 。 一、抗藥性標志的篩選 ? 如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如 ampr或 tetr ， 轉化后只有含這種抗藥基因的轉化子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落 ，這樣就可將轉化菌與非轉化菌區(qū)別開來 。 ? 酵母的雜交方法有孢子雜交法 、 群體交配法 、 單倍體細胞雜交法和罕見交配法 。 5． 選擇性培養(yǎng)基上劃線生長 ， 分離驗證 ， 挑取融合子進一步試驗 、 保藏 。 ? (3)利用微生物轉化改造代謝產物的結構。 ? 為了花費最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選成效，就要求采用效率較高的科學篩選方案和手段。 ? 為了提高組成酶變異株的優(yōu)勢，即它在群體中的比例，可以應用恒化器培養(yǎng)技術。 冷凍保藏種類 一 、 普通冷凍保藏技術 (20℃ ) 二 、 超低溫冷凍保藏技術 (60一 80℃ ) 三 、 液氮冷凍保藏技術 普通冷凍保藏技術 (20℃) ?將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉 ， 然后貯藏于一冰箱的冷藏室中 ， 或于溫度范圍在 5～ 20℃ 的普通冰箱 (20℃ )中 。 (三 )復蘇 1． 從液氮罐中取出所需的安瓿 ， 立即置于冰浴中； 2． 迅速將安瓿置于 3740℃ 水浴中 ， 并輕輕搖動以加速解； 3．用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有 2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復抽吸數(shù)次，然后取 (約 8滴 )轉接入瓊脂斜面上。 7． 維持 40℃ 的醇浴溫度 90120min， 然后調節(jié)溫控裝置 。 ?但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯 、 菌體自溶 、 基因突變 。 而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時 ， 抗生素的加入可幫助維持質粒復制與染色體復制的協(xié)調 。 微生物活力和穩(wěn)定性測定 ? 所有保藏菌種的方法都必須是長期可靠地保持菌種的優(yōu)良性狀不變 。 ? 斜面培養(yǎng)物應在密閉容器中于 5℃ 保藏 ， 以防止培養(yǎng)基脫水并能降低代謝活性 。 8． 關掉可調溫控裝置的降溫探頭 ， 讓醇浴溫度上升至室溫 (25℃ )． 9． 在冷凍干燥的最初 4h內應定期測真空度 ， 在安瓿置于真空下后 1h內 ， 真空度必須達到 ， 并于菌懸液接近干燥時逐漸降到 ～ 。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一 。 ?用此方法可以維持若干微生物的活力 1— 2年 。 ? 2) 循環(huán)培養(yǎng)法：利用不含誘導物的培養(yǎng)環(huán)境和含有誘導物的培養(yǎng)環(huán)境進行交替循環(huán)培養(yǎng)待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。 ? (5)DNA重組技術。 三、原生質體融合育種的要點 （ 一 ） 標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種 ， 篩選出營養(yǎng)缺陷型或／和抗藥性菌株 。 原生質體育種 ? 原生質體育種技術主要有原生質體融合 、 原生質體轉化技術 ， 此外尚有原生質體誘變育種等 。 二、 β －半乳糖苷酶系統(tǒng)篩選 ? 很多載體都攜帶一段細菌的 lacZ基因 ， 它編碼β －半乳糖苷酶 N端的 146個氨基酸 ， 稱為 α －肽 ， 它表達 β －半乳糖苷酶的 C端肽鏈 。 ? 在分子克隆中最有用的的 DNA連接酶是來自Ｔ４噬菌體的 DNA 連接酶 。 ? 常用限制性內切酶 ? 種類及特性 W. Arber,H. O. Smith 限制性內切酶的剪切方式 ? 粘性未端：切開后的兩段 DNA各留下一個尾 ， 這 2個尾的核苷酸順序完全一樣 ， 中是方向相反 。 四、遺傳轉化 轉化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。 生長譜測定的方法 ? 將缺陷型菌株培養(yǎng)后 ， 收集菌體 ， 制備成細胞懸液 ， 與 MM培養(yǎng)基 (融化并涼至 50℃ )混合并傾注平皿 。 ? 菌絲過濾法：對于霉菌 ，