【正文】 ； 研究內(nèi)容 菌種分離取一定量冰箱中保藏的樣品，置于含無菌水和玻璃珠的三角瓶中，將樣品進(jìn)行充分振蕩分散后，涂布到以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng) 1d,選擇菌落分散程度適宜的平板，將對應(yīng)的稀釋度作為最適稀釋度，重復(fù)上述操作過程，以最適稀釋度進(jìn)行稀釋涂布，得到一定量的分離結(jié)果，待菌種篩選備用。每個因素取兩個水平：低水平“1 ”和高水平“1” ， “1”為“1”的 倍，另設(shè)兩個空白項(xiàng)對應(yīng)表中的 X3 和X9，以考察試驗(yàn)誤差。表 23 PlackettBurman 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 23 Factors level and coding in PlackettBurman test因素X1 豆粕/%X2 菊粉/%X3 空白項(xiàng)X4 硫酸銨/%X5 初始 pHX6 磷酸二氫鉀X7 吐溫80/%X8 氯化鈣/mMX9 空白項(xiàng)X10 氯化鎂/mM(2)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)根據(jù) BoxBenhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行三因素三水平兩次重復(fù)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，17 個試驗(yàn)點(diǎn)的設(shè)計(jì)方案如表 5 所示。計(jì)算后，得出果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=，R 2=，經(jīng)檢驗(yàn)顯著后，供菊粉酶活力測定用。在相同條件下，以加入失活的酶液的反應(yīng)液作對照。 圖 31 105 稀釋度下的菊粉酶產(chǎn)生菌分離培養(yǎng)結(jié)果Figure 31 The separation training results of inulin enzyme source in bacteria in 105 dilution 菌種篩選 菌種初篩從上述分離得到的菌株中，挑取菌落形態(tài)不同且長勢較好的單菌落于初篩培養(yǎng)基平板中進(jìn)行劃線，并置于 28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1d，得到 33 株菌株，如圖所示為初篩結(jié)果。表 32 PlackettBurman 試驗(yàn)篩選主要影響因素Table 8 Variance analysis for PlackettBurman experimental results6 23 7 24 8 25 9 26 10 27 11 28 12 29 13 30 14 31 15 32 16 33 17 試驗(yàn)號X1 豆粕X2 菊粉/%X3 空白項(xiàng)X4 硫酸銨/%X5 初始pHX6 磷酸二氫鉀/%X7 吐溫80/%X8 氯化鈣/mMX9 空白項(xiàng)X10氯化鎂/mM酶活力/U1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 對 PlackettBurman 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果如表 33 所示。表 33 PlackettBurman 試驗(yàn)方差分析6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 8 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 方差來源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 *X2 1 X3 1 X4 1 X5 1 *X6 1 X7 1 X8 1 *Table 33 Variance analysis for PlackettBurman experimental results注：*.差異顯著(P＜) ；**.差異極顯著(P＜)。X9 1 X10 1 模型 10 *誤差項(xiàng) 1 總和 11 因素 水平 1 +1 F 值 PrF 重要性豆粕/X 1 % % 2菊粉/X 2 % % 6硫酸銨/X 4 % % 4初始 PH/X5 3磷酸二氫鉀/X 6 % % 7吐溫80/X 7 5氯化鈣/X 8 % % 1氯化鎂/X 9 % % 8表 35 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 35 BoxBenhnken design layout and experimental results通過 designexpert 統(tǒng)計(jì)軟件對表 35 的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，獲得菊粉酶活力(Y)對自變量豆粕添加量 X初始 pH 值 X氯化鈣添加量 X3 的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下：Y=+++表 36 響應(yīng)面方差分析表Table 36 Variance analysis for BoxBenhnken experimental results方差來源 自由度 平方和 均方 F 值 PrF 顯著性X1 1 X2 1 **試驗(yàn)號 X1 X2 X3 Y 酶活力/U1 1 1 0 2 1 1 0 3 1 1 0 4 1 1 0 5 1 0 1 6 1 0 1 7 1 0 1 8 1 0 1 9 0 1 1 10 0 1 1 11 0 1 1 12 0 1 1 13 0 0 0 14 0 0 0 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0 X3 1 **X12 1 *X1X2 1 X1X3 1 X22 1 **X2X3 1 X32 1 **模型 9 **失擬項(xiàng) 3 誤差 4 總和 16 注：*.差異顯著(P ＜) ；**.差異極顯著(P ＜)。由二次多項(xiàng)回歸模型方程得知，方程應(yīng)變量與全體自變量之間線性關(guān)系明顯，回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的均方差和系數(shù)較大，而交互項(xiàng)系數(shù)較小，說明響應(yīng)面分析所選的 3 個因素之間的交互效應(yīng)較小。=0=0=0解得 X1= ，X 2= ，X 3= 。在此條件下，菌種產(chǎn)菊粉酶活力達(dá) 。由于各個研究所使用的菌種不同且都是自己分離，純化的，菌種產(chǎn)地的不同，菌種在當(dāng)?shù)亟?jīng)過長期的生長繁殖適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐奶厥猸h(huán)境，而實(shí)驗(yàn)的菌種僅僅經(jīng)過短期的分離馴化，這很難改變菌種的性能，許多的特殊野生性狀未發(fā)生改變，這也是許多文獻(xiàn)的都對產(chǎn)菊粉酶菌株進(jìn)行分離及發(fā)酵條件研究，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往不同的原因。 展望由于時間及成本和設(shè)備問題，本研究目前只停留在部分發(fā)酵條件即豆粕、菊粉、磷酸氫二鉀、(NH 4。因此，在試驗(yàn)時要定時用溫度計(jì)校正搖床的溫度。4 討論 本試驗(yàn)進(jìn)行了耐低溫菊粉酶產(chǎn)酶菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化研究，但在試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)一些問題，本章將對這些問題逐一進(jìn)行分析討論。即在豆粕添加量 %，初始 pH ，氯化鈣添加量 %的條件下，以菊粉為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵的菊粉酶活力值最大，由回歸方程預(yù)測在此條件下的菊粉酶活力理論值為。由此可知，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，所以，可以利用該回歸方程來確定最佳提取工藝條件。方程模型極顯著(P= ＜) ，說明方程能夠很好的擬和試驗(yàn)結(jié)果。 (2)響應(yīng)面分析方案及結(jié)果對豆粕添加量(A) 、初始 pH(B)、氯化鈣添加量(C)作如下變化：X 1=(A3)/1，X 2=(B)/，X 3=()/，以 XX X 3 為自變量，以發(fā)酵結(jié)束后測得的菊粉酶活性為響應(yīng)面值 Y，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表 10。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平范圍內(nèi) XX 5 和 X8 對菊粉酶活力均有顯著影響 (P＜)，其他因素在所考察的水平范圍內(nèi)對酶活力的影響不顯著。針對初篩得到的 33 株菌株用 DNS 比色法進(jìn)行酶活力測定，得出結(jié)果如表 31 所示，結(jié)果表明 2 號菌株酶活力最高，為 。菊粉酶活力定義為：以菊粉為底物，每分鐘轉(zhuǎn)化生成 1μmol 還原糖所需的酶量為一個酶活力單位(U) 。(3)菊粉酶活力的測定方法發(fā)酵結(jié)束后，取 10mL 發(fā)酵液，6000r/min 離心 10min，取上清，制成粗酶液，4℃ 保存（如馬上能測就不用保存） 。表 24 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案Table 24 The response surface design scheme 菊粉酶活力的測定方法(1)主要試劑的配制 試劑的配制稱取酒石酸鉀鈉 ，溶于 500mL 蒸餾水中，加熱（不超過 50℃） ，于熱溶液中依次加入 3,5二硝基水楊酸 ，NaOH ，苯酚 ，無水亞硫酸鈉 ，攪拌至溶解完全，冷卻后用蒸餾水定容至 1000mL，貯存于棕色瓶中，4℃低溫保存；依次加入藥品時，要一點(diǎn)點(diǎn)緩慢加入，溶一點(diǎn)加一點(diǎn)，不能顛倒順序；%菊粉溶液的配制取醋酸鈉 18g，加冰醋酸 ，加水稀釋成 1000mL 即得；得到的醋酸鈉溶液用 范圍的 pH 紙粗略的檢驗(yàn)其 pH 值即可；然后稱取 2g 菊粉溶于適量的上述醋酸鈉溶液中，由于菊粉在常溫下不易溶解，溶液呈白色渾濁狀，所以對其稍微加熱，并不斷攪拌加速其溶解，至溶液呈無色透明即可，將其轉(zhuǎn)至 100mL 容量瓶中，加醋酸鈉溶液至刻度值即得到 2%菊粉溶液。具體操作：將上述篩選出的高產(chǎn)菌株按照 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)以 3%的接種量接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在三角瓶上對應(yīng)的標(biāo)上試驗(yàn)序號，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測酶活力。(2)菌種復(fù)篩以 3%的接種量將上述分離出的菌株分別接種于 250mL 三角瓶（50mL 裝量）的復(fù)篩（產(chǎn)酶）培養(yǎng)基中，并相應(yīng)標(biāo)記，28℃，180r/min 搖床培養(yǎng) 48h，然后用 DNS 比色法測酶活力，比較篩選出酶活力最高的菌株；并將篩選出的高產(chǎn)菌株保藏于斜面培養(yǎng)基中。室溫下靜置 510min，使菌液浸入培養(yǎng)基，28℃恒