【正文】 ............................................................ 13 II 菌株的形態(tài)特征 ............................................................................................... 13 菌株的生理生化 特征 ....................................................................................... 13 菌種鑒定 ..................................................................................................................... 16 第四章 討論 ............................................................................................................................. 18 結(jié)論 .............................................................................................................................................. 19 參考文獻(xiàn) .................................................................................................................................... 20 致謝 .............................................................................................................................................. 22 III 紅霉素菌種的篩選及鑒定 摘要： 紅霉素 （ erythromycin， Er） 別名愛(ài)紅康，是大家都非常熟悉的一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)堿性抗生素，具有廣譜抗菌活性，紅霉素的抗菌譜和青霉素 G相似，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有抗菌活性。紅霉素是臨床上常用的抗生素之一，其游離堿供口服用，乳酸糖鹽供注射用。由于紅霉素的這種很普遍的用途，所以提高發(fā)酵液中紅霉素產(chǎn)量顯的至關(guān)重要。所以本課題運(yùn)用發(fā)酵方法研究紅霉素菌種的篩選及鑒定，從篩 選的方法和過(guò)程上進(jìn)行詳細(xì)的論述和解釋?zhuān)詈笸ㄟ^(guò)鑒定選擇出了克雷伯氏菌屬、氨基酸球菌屬和變形菌屬這幾種優(yōu)秀菌種。雖然現(xiàn)今抗菌藥物越來(lái)越多 , 但 紅霉素在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍然有很重要的地位。 紅霉素是從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來(lái)的一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)堿性抗生素，具有廣譜抗菌活性。經(jīng)過(guò)多年的不斷努力，我國(guó)成為全球第一大紅霉素原料藥生產(chǎn)國(guó)，而紅霉素的應(yīng)用也逐漸國(guó)際化，我國(guó)的這種原料優(yōu)勢(shì)使我國(guó)自然成為歐美和東南亞地區(qū)紅霉素原料藥的主要供應(yīng)國(guó)。 本實(shí)驗(yàn)研究紅霉素產(chǎn)生菌的篩選及鑒定，提高紅霉素的質(zhì)量和產(chǎn)量，使它能更好的用于抗生素類(lèi)藥物研究。 2 第一章 緒論 紅霉素 （ erythromycin， Er）是紅色糖多孢菌（ Saccharopolysporaerythraea）的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種十四元大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)堿性抗生素。在醫(yī)學(xué)發(fā)展的過(guò)程中，紅霉素衍生物的興起使母體紅霉素的需求大大增加。當(dāng)國(guó)外發(fā)酵單位已達(dá) 8000U/mL~ 12021U/mL 的時(shí)候 ， 我國(guó)還處于研究開(kāi)發(fā)階段 。為此我國(guó)學(xué)者為提高紅霉素發(fā)酵水 平在紅霉素發(fā)酵、提取工藝優(yōu)化、菌種篩選鑒定方面作了較多研究工作。阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等都是紅霉素的半合成品，它們的出現(xiàn)以及紅霉素應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)大都快速拉動(dòng)了紅霉素原料藥的生產(chǎn)需求。由于我們對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成機(jī)制了解的不是太全面，常規(guī)的誘變選育的方法存在很多缺點(diǎn)如：周期長(zhǎng)、效率低 和隨機(jī)性大。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)際上對(duì)紅霉素 產(chǎn)生菌種的基因工程改造進(jìn)行了諸多嘗試，然而研究者并不是對(duì)紅霉素生物合成的次生代謝途徑做特異性的遺傳修飾，而是著力于與產(chǎn)生紅霉素相關(guān)的底物供應(yīng)或者是限制紅霉素產(chǎn)生的因素上。 生產(chǎn)工藝優(yōu)化研究現(xiàn)狀 發(fā)酵是紅霉素生產(chǎn)過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有操作經(jīng)驗(yàn)的操作者通過(guò)生產(chǎn)過(guò)程中的信息和自己的經(jīng)驗(yàn)知識(shí)，需要隨時(shí)補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)物料，調(diào)整基質(zhì) ，使微生物沿著理想的生長(zhǎng)代謝方式進(jìn)行?，F(xiàn)在 人們都懂得一個(gè)道理 ： 是藥三分毒 ， 任何藥物或許都存在一定的副作用 。因此，提高紅霉素發(fā)酵液中 ErA的含量和純度，降低副產(chǎn)物 ErB、 ErC含量，是當(dāng)前紅霉素生產(chǎn)的一個(gè)重要問(wèn)題 [6]。所以這方面的研究還處于試驗(yàn)階段。 它是白色或類(lèi)白色的結(jié)晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類(lèi)、丙酮、氯仿、酯類(lèi)（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。在室溫和 pH 6～ 8的條件下，其溶液相當(dāng)穩(wěn)定，溫度升高穩(wěn)定性下降。且具有旋光性和紫外吸收峰。我國(guó)于 1957年試制成功并投入生產(chǎn)。 紅霉素是廣譜抗生素 ,其抗菌譜和青霉素 G相似 , 特別對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、抗酸桿菌、立克次氏體及病毒有抗菌活性 , 不但 由耐藥性金黃色葡萄球菌感染和溶血性鏈球菌感染所引致的疾病可以用紅霉素治療 , 對(duì)青霉素過(guò)敏的患者也可以使用紅 霉素 。 另外，紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如下： 4 紅霉素的特點(diǎn) 紅霉素是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的代表藥 ， 其抗菌作用在同類(lèi)中較強(qiáng) ；在堿性環(huán)境中作用較強(qiáng)， pH 值小于 4時(shí)幾乎沒(méi)有抗菌作用；主要使用各種革蘭陽(yáng)性菌感染，特別是耐青霉素的葡萄球菌感染和青霉素過(guò)敏的病人，還可用于白喉帶菌者、百日咳、軍團(tuán)菌、厭氧菌感染等敏感性前列腺炎；口服大劑量可出現(xiàn)腸道反應(yīng)；紅霉素酯化物可引起肝臟損傷，停藥后數(shù)日可恢復(fù)；靜脈用藥時(shí)宜用葡萄糖液而不用含鹽液體。在 甲醇 、乙醇或丙酮中易溶，在水中極微溶解。常用于對(duì)青霉素耐藥的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌感染及對(duì)青霉素過(guò)敏的患者。 5 第二章 材料與方法 材料與儀器 試驗(yàn)材料 本次試驗(yàn)材料取自學(xué)校實(shí)驗(yàn)室的紅霉素鏈霉菌 試驗(yàn)試劑 甲基紅指示劑，酚酞指示劑，次甲基藍(lán)， 12%中性甲醛，硼酸溶液，濃硫酸； 葡萄糖：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； 乙酸 ：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； 無(wú)水乙醚 ：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純； 次甲基藍(lán) ：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； 亞鐵氰化鉀 ：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純； KH2PO4：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； K2HPO4：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； ZnSO4： 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ，分析純； NaCl：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； NaOH：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； CuSO4： 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 ，分析純； Cu2O：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； KMnO4：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純； KI：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純 。 試驗(yàn)方法 紅霉素發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵過(guò)程，在發(fā)酵過(guò)程中，需不斷通入無(wú)菌空氣并攪拌，以維持一定的罐壓和溶氧。生產(chǎn)中還要加入消泡劑以控制泡沫。 發(fā)酵液的預(yù)處理和過(guò)濾 發(fā)酵液中除含有約 %的紅霉素外，絕大部分是菌絲體、蛋白質(zhì)、色素、油等雜質(zhì)，會(huì)給提取和精制帶來(lái)很大的困難。一般采用硫酸鋅沉淀蛋白質(zhì)，目的是使菌絲 結(jié)成團(tuán)加快過(guò)濾速度。在處理濾渣時(shí)也會(huì)遇到一些問(wèn)題，因?yàn)殇\離子是有 毒性 的 ， 所以我們 改用堿式氯化鋁 處理濾渣 。紅霉素發(fā)酵液過(guò)濾采用板框過(guò)濾機(jī)。 如果是 純紅霉素堿 那么 在水中溶解度較小，并 且會(huì) 隨溫度升高而減小，在 55℃時(shí)溶解度最小，當(dāng) pH＞ 時(shí)紅霉素基本以游離堿的形式存在，能溶于乙酸丁酯中，當(dāng) pH＜ 時(shí)，紅霉素以鹽的形式存在，其在水中的溶解度隨 pH 降低而迅速增大。 發(fā)酵方法 A．搖瓶培養(yǎng) 用種子培養(yǎng)冷凍管取紅霉素菌種接種于 30 度 母斜面 上 ，養(yǎng) 7d 接 種于 30 度 子斜面繼續(xù)培養(yǎng) ， 7d 后接種于一級(jí)種子瓶。搖瓶裝液量為 50ml/250ml，每組結(jié)果均為 5只搖瓶的平均效價(jià)。 8 第三章 試驗(yàn)結(jié)果 選因素、定水平 （ 1）僅超聲波誘變法定水平 分別取 10ml 出發(fā)菌株的菌懸液于 30 支 25ml 的試管中，放入超聲波清洗器中，水淹沒(méi)至試管 2/3 左右，進(jìn)行超聲波處理。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：隨著超聲波誘變時(shí)間的增長(zhǎng)，紅色糖多胞菌的致死率都在不斷的增加；在 3 個(gè)不同功率的超聲波誘變中，超聲波功率為 200w 時(shí)，隨著誘變時(shí)間的增長(zhǎng)，致死率上升得不明顯，誘變效果不顯著；超聲波功率為400ｗ時(shí)，紅色糖多胞菌很快就全部致死，反而沒(méi)有達(dá)到誘變效果；超聲波功率為 300ｗ時(shí)，誘變時(shí)間 20min，致死率接近 83%，且平板上的紅色糖多胞菌菌落大小不均一，誘變效果較好。根據(jù)菌株致死率來(lái)判斷誘變效果。隨著氯化鋰濃度的提高，致死率也隨著提高，當(dāng)氯化鋰濃度超過(guò) %時(shí)，紅色糖多胞菌的致死率增加幅度不在顯著，因此在誘變中氯化鋰濃度確定為 %。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況選定的因素及其水平： 因素 A：超聲波功率（ W） 水平： 200W 300W 400W 因素 B:誘變時(shí)間（ min） 9 水平： 10min 20min 30min 因素 C:LiCl 濃度（ %） 水平： 因素 D： LiCl 使用方法 水平： 培養(yǎng)基中加入 LiCl 孢子懸浮液里 4h 同時(shí)處理 可以確定此實(shí)驗(yàn)為四因素、三水平實(shí)驗(yàn)，可以選擇正交表 L9(34) 項(xiàng)目 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 表頭設(shè)計(jì) 水平 A、 超聲波功率 （ W） B、誘變時(shí)間 （ min） C、 Licl 濃度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培養(yǎng)基中加 Licl 2 300 20 孢子懸浮液處理 3 400 30 同時(shí)處理 頂行：實(shí)驗(yàn)考慮的因素 最左列：實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的次數(shù)，每一列代表試驗(yàn)中安排的各個(gè)因素的水平 實(shí)驗(yàn)方案及其實(shí)驗(yàn)結(jié)果 水平 A、超聲波功率 （ W） B、誘變時(shí)間 （ min） C、 Licl 濃度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培養(yǎng)基中加 Licl 2 300 20 孢子懸浮液處理 3 400 30 同時(shí)處理 10 試驗(yàn)號(hào) A B C D 生物效價(jià)（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 試驗(yàn)號(hào) A B C D 生物效價(jià)（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3