【文章內容簡介】 ：超聲波功率（ W） 水平： 200W 300W 400W 因素 B:誘變時間（ min） 9 水平： 10min 20min 30min 因素 C:LiCl 濃度（ %） 水平： 因素 D： LiCl 使用方法 水平： 培養(yǎng)基中加入 LiCl 孢子懸浮液里 4h 同時處理 可以確定此實驗為四因素、三水平實驗，可以選擇正交表 L9(34) 項目 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 表頭設計 水平 A、 超聲波功率 （ W） B、誘變時間 （ min） C、 Licl 濃度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培養(yǎng)基中加 Licl 2 300 20 孢子懸浮液處理 3 400 30 同時處理 頂行：實驗考慮的因素 最左列：實驗進行的次數，每一列代表試驗中安排的各個因素的水平 實驗方案及其實驗結果 水平 A、超聲波功率 （ W） B、誘變時間 （ min） C、 Licl 濃度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培養(yǎng)基中加 Licl 2 300 20 孢子懸浮液處理 3 400 30 同時處理 10 試驗號 A B C D 生物效價（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 試驗號 A B C D 生物效價（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 11 （ 1）實驗結果中重要數據的計算方法： K1即第 j列上水平號為 1 的各實驗結果之和的平均值 K2 即第 j 列上水平號為 2的各實驗結果之和的平均值 K3 即第 j 列上水平號為 3的各實驗結果之和的平均值 R 即第 j列的極差或其所在因素的極差 （ 2）計算公式： Rj=MAX{Kj}MIN{kj} R 值（極差）的作用，一般來說，各列的 R 值（極差）是不相等的，這說明各因素改變時對實驗結果的影響是不相同的。極差越大，說明這個因素的水平的改變對實驗結果的影響越大。極差最大的那一列的因素，就是因素的水平改變對實驗結果影響最大的因素 ，也就是最主要的因素。本題中： DBAC,即因素的影響程度為：氯化鋰使用方法＞超聲波誘變時間 ＞超聲波功率＞氯化鋰濃度。 (3)分析結果確定最優(yōu)實驗方案 挑選因素的最優(yōu)水平與所要求的指標有關，若指標越大越好，則應該選取使指標大的水平，即各列 K1j、 K2j、 K3j 中最大的那個水平：反之，若指標越小越好，則應該選取使指標小的那個水平。本題中的實驗目標是提高紅霉素的產量，指標越大越好，所以應該選取每個因素的 K1j、 K2j、 K3j 中最大的那個水平。結合表中可以得到實驗號為 6 的誘變菌株的相對效價較高，其中 5 號菌株的效果最好，其最佳誘變方法為將 5號菌株進行檢測，其發(fā)酵水平比出發(fā)菌株提高了很多。 5號菌株即為正交實驗所得到的最優(yōu)結果 （ 4） 小結： 正交實驗的缺點： 實驗次數太多，費時、費事； 不做重復實驗就無法估計誤差； 無法區(qū)分因素的主次； 正交實驗的優(yōu)點： 試驗點代表性強，試驗次數少； 不需要重復實驗，就可以估計實驗誤差； 可以分清因素的主次； 可以使用數理統(tǒng)計的方法處理實驗結果，提出好的條件； 12 試驗號 A B C D 生物效價（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 因素主次： DBAC 最優(yōu)方案 : A2B2C3D1 菌種的初篩與馴化 如果通過自然篩選獲得高效菌種需要較長的時間，所以通過人工富集培養(yǎng)分離，篩選出降解能力強的高效菌株，是篩選鑒定過程中獲取適宜菌種的有效途徑。我們在實驗室采用富集培養(yǎng)的方法，從自然界篩選馴化降解紅霉素的高效菌株，并對菌株進行初步的鑒定，研究外界的營養(yǎng)與環(huán)境對條件對菌株生長的影響，以便在實際應用中通過控制適當的條件達到最佳的生長效果。 紅霉素產生菌的篩選和鑒定 將含有所要篩選的微生物的污泥按搖瓶培養(yǎng)的步驟操作 ,分別往 50ml 普通培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 5ml 活性污泥 33℃厭氧條件下進行富集培養(yǎng)。取 5mL最終 富集液分別接種于紅霉素濃度為 l00mg/L的馴化培養(yǎng)基中 ,在 33℃厭氧條件下培養(yǎng) 48h。取培養(yǎng)后的該培養(yǎng)液 5mL 再接種馴化培養(yǎng)基中 ,紅霉素濃度為 13 200mg/L,在上述條件繼續(xù)下培養(yǎng)。重復上述過程 ,馴化培養(yǎng)基中抗生素含量逐漸加大 ,而碳氮源的含量逐漸降低 ,直至紅霉素濃度達到 2021mg/L。 菌種的復篩與分離純化達到目標濃度后 ,取一環(huán)菌懸液按稀釋、平板分離法進行操作 ,待菌株生長后 ,選取長勢最好 ,且形態(tài)穩(wěn)定相似的菌落按三平板劃線分離法進一步分離純化 ,最后在馴化培養(yǎng)基一中獲得 3 株菌株 ,對它們進行編號分別為 :A、 B 和 C,接種至斜面并保存于冰箱中 ,以備進一步的馴化以及后續(xù)試驗使用。 菌株的生物學特性及鑒定 菌株的形態(tài)特征 經過馴化篩選后得到的幾株菌株的形態(tài)特征如下 A:在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上菌落呈略黃色 ,半透明 ,表面隆起 ,光滑但不濕潤 ,中間顏色較周邊深 ,菌落呈不規(guī)則狀且較小 ,邊緣呈波狀。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長 ,這表明 A 為兼性厭氧菌。用光學顯微鏡觀察該菌的菌體形狀呈短桿狀 ,革蘭氏染色后菌體呈紫紅色 ,判斷為革蘭氏陰性菌 。無莢膜 ,無芽孢。 B:在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上菌落呈淡黃色 ,不透明 ,表面呈凸透鏡狀 ,光滑濕潤 ,菌落呈不規(guī)則狀且較小 ,邊緣規(guī)則且光滑。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長 ,這表明 B為兼性厭氧菌。用光學顯微鏡觀察 ,該菌的菌體形狀呈球狀 ,革蘭氏染色后菌體呈紫紅色 ,屬于革蘭氏陰性菌 。無莢膜 ,無芽孢。 C:在牛肉膏蛋白脈固體培養(yǎng)基上菌落呈黃色 ,不透明 ,表面呈凸透鏡狀 ,光滑較濕潤 ,菌落呈圓形 ,邊緣規(guī)則且光滑。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長 ,這表明 C 為兼性厭氧菌。用光學顯微鏡觀察 ,該菌的菌體形狀呈桿狀 ,革蘭氏染色后菌體呈紫 紅色 ,屬于革蘭氏陰性菌 。無莢膜 ,無芽孢。 菌株的生理生化特征 （ 1）唯一碳源試驗 本實驗的原理是不同菌種在碳源一樣的培養(yǎng)基中，由于其利用情況不同會影響菌株的生長，我們可以根據菌株生長情況來判斷其對該碳源的利用情況。所以我們將 A、 B和 C接種到這種特定的含各種不同氮源的碳源試驗培養(yǎng)基上后 ,各培養(yǎng)基中菌株的生長情況如下表所示 : 14 唯一碳源實驗結果 菌種編號 葡萄糖 乙醇 蔗糖 DL甲硫氨基酸 檸檬酸 草酸 A +++ +++ ++ + + + B +++ +++ +++ ++ — — C ++ + ++ — — — 上表說明 A 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、 DL甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸作為唯一碳源 。B 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、 DL甲硫氨基酸為唯一碳源 ,不能利用檸檬酸和草酸 。C 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖為唯一碳源 ,不能利用 DL甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸。 （ 2）唯一氮源試驗 唯一氮源試驗就是在碳源不同而氮源卻唯一確定的的情況下看看各菌株的利用情況，所以要將 A、 B和 C接種特定試驗培養(yǎng)基上 ,我們通過看 各培養(yǎng)基中菌株的生長情況來判斷利用狀況。 唯一氮源實驗結果 菌種編號 硫氨酸 酵母膏 硝酸胺 蛋白胨 硝酸鉀 A +++ +++ ++ ++ + B + +++ +++ ++ + C ++ + + — — 上表說明 A和 B能夠利用硫酸按、酵母膏、硝酸按、蛋白胨和硝酸鉀作為唯一氮源 。而 C能夠利用硫氨酸、酵母膏和硝酸胺作為唯一氮源 ,卻 不能利用蛋白胨和硝酸鉀。 （ 3）運動性試驗 將接種過三種菌種的試管分別直立放于試管架上 ,并把它們 放在恒溫箱中用適宜溫度培養(yǎng)，經定期觀察發(fā)現 ,A、 B、 C 接種后菌株僅在在接種線處生長 ,細而密 ,并未出現擴散。這說明 A、 B、 C都不具有運動性。 （ 4）糖、醇、糖苷類碳源的分解試驗 不同的細菌在分解糖或醇 (如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油 )的能力上 15 有很大差異。菌種在發(fā)酵后能產生各種有機酸 (如乳酸、醋酸、甲酸琥珀酸 )及各種氣體 (如 H CO CH4)。酸的產生可以用指示劑來指示。我們在配制培養(yǎng)基時預先加入澳百里酚藍 ,當細菌發(fā)酵產酸時 ,培養(yǎng)基的顏色就會由紫色變?yōu)辄S色。氣體的產生可由糖發(fā)酵管中倒立的杜氏小管中的氣泡的有無來證明。 實驗結果如下所示， A 菌種的發(fā)酵結果既產酸又產氣， B 菌種能產酸但不產氣， C菌種既不產酸又不產氣。 糖、醇、糖苷類碳源的分解實驗結果 菌種 A B C 實驗結果 ++ + — 注： ++表示產酸產氣 +表示產酸不產氣 —表示不產酸不產氣 （ 5）淀粉水解試驗 我們知道，有些菌種可以合成淀粉酶并把它分泌到胞外。而淀粉酶可以把淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖 。 淀粉的特性是遇碘變藍 ， 但 淀