【正文】 excellent strains Key Words: Erythromycin Antibiotics Ferment Saccharopolyspora streptomycete 1 引言 紅霉素 （ erythromycin， Er） 的發(fā)現和應用已有很長時間的歷史。雖然現今抗菌藥物越來越多 , 但 紅霉素在醫(yī)學領域仍然有很重要的地位。 對青霉素過敏、具有耐藥菌感染的患者可以使用紅霉素 , 它也 對支原體、軍團菌和厭氧球菌感染等有效，所以它的適應癥還在擴大。 紅霉素是從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來的一種大環(huán)內酯類堿性抗生素，具有廣譜抗菌活性。正是由于紅霉素的這種廣泛而必不可少的用途，我國一直在不斷地開發(fā)該領域的應用價值。經過多年的不斷努力，我國成為全球第一大紅霉素原料藥生產國，而紅霉素的應用也逐漸國際化，我國的這種原料優(yōu)勢使我國自然成為歐美和東南亞地區(qū)紅霉素原料藥的主要供應國。這也給中國的經濟發(fā)展做出了不小的貢獻。 本實驗研究紅霉素產生菌的篩選及鑒定，提高紅霉素的質量和產量，使它能更好的用于抗生素類藥物研究。同時也可以增強社會認知度，擴大市場需求，使紅霉素的影響更 廣泛，為人們更好的認識了解紅霉素打下基礎。 2 第一章 緒論 紅霉素 （ erythromycin， Er）是紅色糖多孢菌（ Saccharopolysporaerythraea）的次級代謝產物，是一種十四元大環(huán)內酯類堿性抗生素。它的抗菌譜和青霉素 G 相似，特別對抗酸桿菌、革蘭氏陽性細菌、病毒及立克次氏體有抗菌活性，如果某些疾病是由耐藥性金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌感染引起的，那么紅霉素應該是首先要考慮使用的，它是這方面疾病的首選藥物。在醫(yī)學發(fā)展的過程中，紅霉素衍生物的興起使母體紅霉素的需求大大增加。紅霉素的產生主要通過發(fā)酵，而我國紅霉素發(fā)酵水平都比較低而且是重復操作，與發(fā)達國家相比差距還比較大。當國外發(fā)酵單位已達 8000U/mL~ 12021U/mL 的時候 ， 我國還處于研究開發(fā)階段 。由于這些原因造成我國生產紅霉素的利潤很低。為此我國學者為提高紅霉素發(fā)酵水 平在紅霉素發(fā)酵、提取工藝優(yōu)化、菌種篩選鑒定方面作了較多研究工作。 總體研究現狀 在人類與致病微生物的斗爭歷史上，以抗生素為代表的微生物藥物起到了至關重要的作用。阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素等都是紅霉素的半合成品，它們的出現以及紅霉素應用領域的擴大都快速拉動了紅霉素原料藥的生產需求。因為紅霉素是一種廣譜抗生素藥物，在臨床上應用廣泛，所以以提高其產生菌種發(fā)酵單位為目的的遺傳育種工作一直未曾停止。由于我們對微生物次級代謝產物的生物合成機制了解的不是太全面，常規(guī)的誘變選育的方法存在很多缺點如：周期長、效率低 和隨機性大。所以近年來我們在紅霉素高產菌株的篩選方面收效不大。隨著分子生物學技術的發(fā)展，國際上對紅霉素 產生菌種的基因工程改造進行了諸多嘗試，然而研究者并不是對紅霉素生物合成的次生代謝途徑做特異性的遺傳修飾，而是著力于與產生紅霉素相關的底物供應或者是限制紅霉素產生的因素上。因此，當紅霉素生產中面臨的有效組分偏低等這些問題時，我們缺乏有效的針對性的解決辦法。 生產工藝優(yōu)化研究現狀 發(fā)酵是紅霉素生產過程的一個關鍵環(huán)節(jié)，具有操作經驗的操作者通過生產過程中的信息和自己的經驗知識，需要隨時補加營養(yǎng)物料，調整基質 ，使微生物沿著理想的生長代謝方式進行。在發(fā)酵過程中，盡管對環(huán)境的參數，如發(fā)酵溫度、 pH值、溶解氧濃度（ DO）、 3 接種量等都可以控制得很好，但是由于微生物生長過程是微觀的、不能隨時掌握，發(fā)酵過程中的關鍵變量如總糖濃度、菌絲濃度不可在線測量，使得發(fā)酵過程的控制問題變得很復雜 [3]?，F在 人們都懂得一個道理 ： 是藥三分毒 ， 任何藥物或許都存在一定的副作用 。歐洲藥典規(guī)定在紅霉素產品中 ErB的含量不能超過 5%。因此，提高紅霉素發(fā)酵液中 ErA的含量和純度，降低副產物 ErB、 ErC含量，是當前紅霉素生產的一個重要問題 [6]。發(fā)酵過程中可能會產生某些雜質，通過簡單的預處理可能很難完全去除，會導致紅霉 A、 B、 C的分離效果不好，而常用的預處理方法在萃取紅霉素時又會造成很大損失。所以這方面的研究還處于試驗階段。 紅霉素簡介 紅霉素是 1952 年從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來的一種 14 元環(huán)大環(huán)內醋類堿性抗生素。 它是白色或類白色的結晶性粉末，微有吸濕性，味苦，易溶于醇類、丙酮、氯仿、酯類（如乙酯、丁酯、戊酯等），微溶于乙醚。在水中的溶解度為 2mg/ml（ 25℃ 左右），它隨著溫度的升高而減少。在室溫和 pH 6～ 8的條件下，其溶液相當穩(wěn)定，溫度升高穩(wěn)定性下降。紅霉素熔點為 135～ 140℃ （游離堿水合物）， 190～ 193℃ （無水游離堿）。且具有旋光性和紫外吸收峰。紅霉素堿能和有機酸或無機酸類結合成鹽，其鹽類易溶于水 [7]。我國于 1957年試制成功并投入生產。 紅霉素 是國內外應用最廣的大環(huán)內酯類抗生素之一 。 紅霉素是廣譜抗生素 ,其抗菌譜和青霉素 G相似 , 特別對革蘭氏陽性細菌、抗酸桿菌、立克次氏體及病毒有抗菌活性 , 不但 由耐藥性金黃色葡萄球菌感染和溶血性鏈球菌感染所引致的疾病可以用紅霉素治療 , 對青霉素過敏的患者也可以使用紅 霉素 。紅霉素在臨床上的應用也很廣泛， 主要用于呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。 另外，紅霉素是大環(huán)內酯類抗生素。這類抗生素結構具有聚烯酮衍生的，被一內酯鍵閉合的大環(huán)內酯骨架，并通過羥基以糖苷鍵聯(lián)結 1～ 3 個罕有的中性或堿性糖?；瘜W結構如下： 4 紅霉素的特點 紅霉素是大環(huán)內酯類抗生素的代表藥 ， 其抗菌作用在同類中較強 ；在堿性環(huán)境中作用較強， pH 值小于 4時幾乎沒有抗菌作用；主要使用各種革蘭陽性菌感染，特別是耐青霉素的葡萄球菌感染和青霉素過敏的病人，還可用于白喉帶菌者、百日咳、軍團菌、厭氧菌感染等敏感性前列腺炎；口服大劑量可出現腸道反應；紅霉素酯化物可引起肝臟損傷，停藥后數日可恢復；靜脈用藥時宜用葡萄糖液而不用含鹽液體。 紅霉素的性狀 紅霉素為白色或類白色的結晶或 粉末 ；無臭，味苦；微有引濕性。在 甲醇 、乙醇或丙酮中易溶，在水中極微溶解。 紅霉素的藥理作用 類似芐青霉素，對革蘭陽性菌有強大抗菌作用，包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、白喉棒狀桿菌及梭狀芽孢桿菌；對革蘭陰性菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、百日咳鮑特菌、布魯菌有較強作用；對嗜肺軍團菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體也有作用。常用于對青霉素耐藥的革蘭陽性細菌感染及對青霉素過敏的患者。首選于軍團菌肺炎、支原體肺炎、白喉帶菌者、沙眼衣原 體所致的嬰兒肺炎及結腸炎；也可用于扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎、大葉性肺炎等。 5 第二章 材料與方法 材料與儀器 試驗材料 本次試驗材料取自學校實驗室的紅霉素鏈霉菌 試驗試劑 甲基紅指示劑，酚酞指示劑，次甲基藍， 12%中性甲醛，硼酸溶液，濃硫酸； 葡萄糖：北京益利精細化學品有限公司，分析純； 乙酸 ：北京益利精細化學品有限公司，分析純； 無水乙醚 ：北京奧博星生物技術責任有限公司，分析純； 次甲基藍 ：北京益利精細化學品有限公司，分析純； 亞鐵氰化鉀 ：北京奧博星生物技術責任有限公司，分析純； KH2PO4：北京益利精細化學品有限公司，分析純； K2HPO4：北京益利精細化學品有限公司，分析純； ZnSO4： 國藥集團化學試劑有限公司 ，分析純； NaCl：北京益利精細化學品有限公司，分析純； NaOH：北京益利精細化學品有限公司，分析純； CuSO4： 國藥集團化學試劑有限公司 ，分析純； Cu2O：北京益利精細化學品有限公司，分析純； KMnO4：北京益利精細化學品有限公司，分析純； KI：北京奧博星生物技術責任有限公司，分析純 。 試驗儀器 試管，移液管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，燒杯，錐形瓶，量筒，堿式滴定管，酸式滴定管，膠頭滴管，蒸發(fā)皿，石棉網，小漏斗，試管架，試管夾 ，漏斗，漏斗架 ； 電子天平 (FA2104；上海恒平科學儀器有限公司 )； 分光光度計 (VIS7220N；北京瑞利分析儀器公司 )； 電熱恒溫水浴鍋 (GSY10；北京市醫(yī)療設備廠 )； 臺式高速離心機 (TGL20；武漢中科儀器發(fā)展有限公司 )； 旋轉蒸發(fā)器 (RE5299；上海亞榮生化儀器廠 )； 索氏提取器 (SXT02；上海洪紀儀器設備有限公司 )； 6 凱式定氮裝置 (SBD100；北京市通潤源機電技術 有限公司 )； 調溫電爐 (SXL1200；上海大恒光學精密機械有限公司 )； 酸度計 (MP9000；上海大恒光學精密機械有限公司 )； 水浴鍋 (DZKW)， 100 mL 三角瓶 ， 10 mL 刻度吸管， 25 mL 刻度吸管，酸式滴定管， 100 mL 容量瓶， 250 mL 錐形瓶， 大試管： 9 支，容量瓶： 50 mL2 ，刻度吸管： 1 mL3 ， 2 mL1 ，5 mL1 。 試驗方法 紅霉素發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵過程，在發(fā)酵過程中，需不斷通入無菌空氣并攪拌，以維持一定的罐壓和溶氧。發(fā)酵過程中應嚴格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液還原糖量、 pH值、溶氧量及發(fā)酵液粘度等，以便紅色糖多孢菌能夠大量合成紅霉素并排至胞外。生產中還要加入消泡劑以控制泡沫。在發(fā)酵期間每隔一定時間也要取樣進行分析、鏡檢及無菌試驗，檢測生產狀況，分析或控制相關參數。 發(fā)酵液的預處理和過濾 發(fā)酵液中除含有約 %的紅霉素外，絕大部分是菌絲體、蛋白質、色素、油等雜質，會給提取和精制帶來很大的困難。尤以蛋白質和油等的存在，在溶媒萃取時將產生嚴重的乳化現象。一般采用硫酸鋅沉淀蛋白質，目的是使菌絲 結成團加快過濾速度。因為硫酸鋅呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而被破壞，我們一般要用 NaoH 來調節(jié) pH值。在處理濾渣時也會遇到一些問題，因為鋅離子是有 毒性 的 ， 所以我們 改用堿式氯化鋁 處理濾渣 。經過預處理的發(fā)酵液便可進行過濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質。紅霉素發(fā)酵液過濾采用板框過濾機。 紅霉素的提取 紅霉素分子結構中有一個二甲基氨 基官能團，是一個弱堿，在酸性條件下與某些酸會形成鹽，如紅霉素乳酸鹽。 如果是 純紅霉素堿 那么 在水中溶解度較小，并 且會 隨溫度升高而減小，在 55℃時溶解度最小，當 pH＞ 時紅霉素基本以游離堿的形式存在，能溶于乙酸丁酯中，當 pH＜ 時，紅霉素以鹽的形式存在，其在水中的溶解度隨 pH 降低而迅速增大。提取方法是在乙酸丁酯及 水溶液（乙酸緩沖液）中反復萃取。 發(fā)酵方法 A．搖瓶培養(yǎng) 用種子培養(yǎng)冷凍管取紅霉素菌種接種于 30 度 母斜面 上 ，養(yǎng) 7d 接 種于 30 度 子斜面繼續(xù)培養(yǎng) ， 7d 后接種于一級種子瓶。 30000r/min 培養(yǎng) 4856h轉入二級種子瓶 30000r/min 繼 7 續(xù)培養(yǎng) 2630h，發(fā)酵培養(yǎng)將上培養(yǎng)好的二級種子接種于發(fā)酵瓶， 30000r/min 培養(yǎng) 16h。搖瓶裝液量為 50ml/250ml，每組結果均為 5只搖瓶的平均效價。 B．發(fā)酵罐培養(yǎng) 種子培養(yǎng) 的步驟與搖瓶培養(yǎng)相同， 發(fā)酵培養(yǎng) 就是將上面培養(yǎng)好的二級種子接種于 3L發(fā)酵罐自動發(fā)酵， 同時 控制發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、 PH、 接種量、攪拌速度和溶解氧等條件，培養(yǎng) 16h。 8 第三章 試驗結果 選因素、定水平 （ 1）僅超聲波誘變法定水平 分別取 10ml 出發(fā)菌株的菌懸液于 30 支 25ml 的試管中，放入超聲波清洗器中，水淹沒至試管 2/3 左右，進行超聲波處理。 超聲波功率分別為 200W、 300W、400W，誘變時間分別為 0min、 3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 18min、 2min、24min、 27min、 30min。 根據實驗結果可以發(fā)現：隨著超聲波誘變時間的增長，紅色糖多胞菌的致死率都在不斷的增加；在 3 個不同功率的超聲波誘變中，超聲波功率為 200w 時，隨著誘變時間的增長，致死率上升得不明顯，誘變效果不顯著；超聲波功率為400ｗ時，紅色糖多胞菌很快就全部致死，反而沒有達到誘變效果；超聲波功率為 300ｗ時，誘變時間 20min，致死率接近 83%，且平板上的紅色糖多胞菌菌落大小不均一，誘變效果較好。 （ 2）僅 LiCl 誘變法定水平 Licl 誘變法定水平的實驗采用兩種方法：一是在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鋰；二是用不同濃度的氯化 鋰處理孢子后在培養(yǎng)。根據菌株致死率來判斷誘變效果。 根據實驗結果：第一種方法能取得比較好的致死效果，可能是因為在培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基中始終有氯化鋰存在，對紅色糖多胞菌起著長期誘變的作用，因此誘變效果更好。隨著氯化鋰濃度的提高，致死率也隨著提高，當氯化鋰濃度超過 %時，紅色糖多胞菌的致死率增加幅度不在顯著，因此在誘變中氯化鋰濃度確定為 %。在正交實驗中，氯化鋰濃度分別選 %、 %、 %三個水平，并分別采用兩種方法進行實驗。 根據實驗具體情況選定的因素及其水平： 因素 A