【正文】 時(shí)光荏苒，轉(zhuǎn)眼我已經(jīng)要畢業(yè)了，在學(xué)校的這幾年我覺(jué)得我成長(zhǎng)了很多，學(xué)會(huì)了很多東西。通過(guò)對(duì)各種菌種的形態(tài)和性能對(duì)比，我們篩選出來(lái)的優(yōu)質(zhì)的、符合我們要求的菌種是克雷伯氏菌屬、氨基酸球菌屬和變形菌屬。 19 結(jié)論 本次課題的實(shí)驗(yàn)是在安陽(yáng)工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成，從接種到發(fā)酵再到后來(lái)的菌種篩選及鑒定都有作者和老師共同完成。所以在發(fā)酵過(guò)程中可以不斷監(jiān)測(cè)可控條件的變化，及時(shí)做出應(yīng)對(duì)措施，使損失降到最低。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們也許會(huì)遇到一些難以避免的問(wèn)題，比如發(fā)酵過(guò)程中的污染問(wèn)題、溶氧量的控制問(wèn)題，在紅霉素的生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)紅霉素降解問(wèn)題，還有其含有的雜質(zhì)可能會(huì)影響紅霉素產(chǎn)量和質(zhì)量。 檸檬酸鹽試驗(yàn) 菌種 A B C 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 + — — 注： +表示能利用 — 表示不能利用 菌種鑒定 通過(guò)以上多個(gè)實(shí)驗(yàn)的綜合結(jié)果，我們初步確定了微生物的種類，現(xiàn)在將結(jié)果匯總展示如下： 實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 結(jié)果 A B C 17 細(xì)胞形狀 短針 球形 桿狀 形成芽孢 無(wú) 無(wú) 無(wú) 有莢膜 無(wú) 無(wú) 無(wú) 革蘭氏染色 陰性 陰性 陰性 好氧性 兼性厭氧 兼性厭氧 兼性厭氧 運(yùn)動(dòng)性 無(wú) 無(wú) 無(wú) 糖、醇、糖苷類碳源分解實(shí)驗(yàn) ++ + — 淀粉水解實(shí)驗(yàn) — — — 甲基紅實(shí)驗(yàn) + — — 乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn) — — — 檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn) + — — 初步鑒定結(jié)果表明 A為克雷伯氏菌屬， B為氨基酸球菌屬， C為變形菌屬 18 第四章 討論 本次課題的研究都是基于實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)之上的，是在老師的指導(dǎo)下順利完成的，實(shí)驗(yàn)過(guò)程盡量要求準(zhǔn)確，避免可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤和漏洞，具有科學(xué)依據(jù)。也可以用酚紅水溶液作為指示劑 ,其變色范圍 ， 顏色變化為由黃到紅 。 乙酰甲基甲醇試驗(yàn) 菌種 A B C 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 — — — （ 8）檸檬酸鹽試驗(yàn) 因?yàn)橛行┘?xì)菌可分解檸檬酸形成 CO2,而培養(yǎng)基中鈉離子可以形成碳酸鈉 ,使培養(yǎng)基的堿性增加 ,我們可以在培養(yǎng)基中加入指示劑 ， 根據(jù)培養(yǎng)基中的指示劑變色情況來(lái)判斷試驗(yàn)結(jié)果。我們?cè)谂囵B(yǎng)基中加入乙酰甲基甲醇，看微生物能否分解這種代謝產(chǎn)物來(lái)判定微生物的種類。乙酰甲基甲醇是丙酮酸脫羧縮合和脫羧后轉(zhuǎn)變而成的，丙酮酸又是葡萄糖的代謝產(chǎn)物。這說(shuō)明菌株 A 的培養(yǎng)液 16 中含有有機(jī)酸， B、 C培養(yǎng)液中沒(méi)有產(chǎn)生有機(jī)酸。因?yàn)榕囵B(yǎng)液中含有有機(jī)酸，我們可以加入甲基紅指示劑看培養(yǎng)液顏色變化來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)。 淀粉水解試驗(yàn)結(jié)果 菌種 A B C 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 — — — 注： —表示沒(méi)有淀粉水解能力 （ 6）甲基紅試驗(yàn) 設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)的目的是想看看菌株是否能分解葡萄糖產(chǎn)酸。 試驗(yàn)結(jié)果為菌落周?chē)詾樗{(lán)黑色 ,無(wú)水解圈產(chǎn)生。 淀粉的特性是遇碘變藍(lán) ， 但 淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)。 糖、醇、糖苷類碳源的分解實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌種 A B C 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ++ + — 注： ++表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣 +表示產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 —表示不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 （ 5）淀粉水解試驗(yàn) 我們知道，有些菌種可以合成淀粉酶并把它分泌到胞外。氣體的產(chǎn)生可由糖發(fā)酵管中倒立的杜氏小管中的氣泡的有無(wú)來(lái)證明。酸的產(chǎn)生可以用指示劑來(lái)指示。 （ 4）糖、醇、糖苷類碳源的分解試驗(yàn) 不同的細(xì)菌在分解糖或醇 (如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甘油 )的能力上 15 有很大差異。 （ 3）運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn) 將接種過(guò)三種菌種的試管分別直立放于試管架上 ,并把它們 放在恒溫箱中用適宜溫度培養(yǎng)，經(jīng)定期觀察發(fā)現(xiàn) ,A、 B、 C接種后菌株僅在在接種線處生長(zhǎng) ,細(xì)而密 ,并未出現(xiàn)擴(kuò)散。 唯一氮源實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌種編號(hào) 硫氨酸 酵母膏 硝酸胺 蛋白胨 硝酸鉀 A +++ +++ ++ ++ + B + +++ +++ ++ + C ++ + + — — 上表說(shuō)明 A和 B能夠利用硫酸按、酵母膏、硝酸按、蛋白胨和硝酸鉀作為唯一氮源 。C 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖為唯一碳源 ,不能利用 DL甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸。所以我們將 A、 B和 C接種到這種特定的含各種不同氮源的碳源試驗(yàn)培養(yǎng)基上后 ,各培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)情況如下表所示 : 14 唯一碳源實(shí)驗(yàn)結(jié)果 菌種編號(hào) 葡萄糖 乙醇 蔗糖 DL甲硫氨基酸 檸檬酸 草酸 A +++ +++ ++ + + + B +++ +++ +++ ++ — — C ++ + ++ — — — 上表說(shuō)明 A 能夠利用葡萄糖、乙醇、蔗糖、 DL甲硫氨基酸、檸檬酸和草酸作為唯一碳源 。無(wú)莢膜 ,無(wú)芽孢。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長(zhǎng) ,這表明 C 為兼性厭氧菌。無(wú)莢膜 ,無(wú)芽孢。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長(zhǎng) ,這表明 B為兼性厭氧菌。無(wú)莢膜 ,無(wú)芽孢。在固體培養(yǎng)基平板的表面、中部和底部都有生長(zhǎng) ,這表明 A 為兼性厭氧菌。 菌種的復(fù)篩與分離純化達(dá)到目標(biāo)濃度后 ,取一環(huán)菌懸液按稀釋、平板分離法進(jìn)行操作 ,待菌株生長(zhǎng)后 ,選取長(zhǎng)勢(shì)最好 ,且形態(tài)穩(wěn)定相似的菌落按三平板劃線分離法進(jìn)一步分離純化 ,最后在馴化培養(yǎng)基一中獲得 3 株菌株 ,對(duì)它們進(jìn)行編號(hào)分別為 :A、 B 和 C,接種至斜面并保存于冰箱中 ,以備進(jìn)一步的馴化以及后續(xù)試驗(yàn)使用。取培養(yǎng)后的該培養(yǎng)液 5mL 再接種馴化培養(yǎng)基中 ,紅霉素濃度為 13 200mg/L,在上述條件繼續(xù)下培養(yǎng)。 紅霉素產(chǎn)生菌的篩選和鑒定 將含有所要篩選的微生物的污泥按搖瓶培養(yǎng)的步驟操作 ,分別往 50ml 普通培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 5ml活性污泥 33℃厭氧條件下進(jìn)行富集培養(yǎng)。 5號(hào)菌株即為正交實(shí)驗(yàn)所得到的最優(yōu)結(jié)果 （ 4） 小結(jié)： 正交實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)： 實(shí)驗(yàn)次數(shù)太多，費(fèi)時(shí)、費(fèi)事； 不做重復(fù)實(shí)驗(yàn)就無(wú)法估計(jì)誤差； 無(wú)法區(qū)分因素的主次； 正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)： 試驗(yàn)點(diǎn)代表性強(qiáng)，試驗(yàn)次數(shù)少； 不需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)，就可以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差； 可以分清因素的主次； 可以使用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出好的條件； 12 試驗(yàn)號(hào) A B C D 生物效價(jià)（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 因素主次： DBAC 最優(yōu)方案 : A2B2C3D1 菌種的初篩與馴化 如果通過(guò)自然篩選獲得高效菌種需要較長(zhǎng)的時(shí)間，所以通過(guò)人工富集培養(yǎng)分離，篩選出降解能力強(qiáng)的高效菌株，是篩選鑒定過(guò)程中獲取適宜菌種的有效途徑。本題中的實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)是提高紅霉素的產(chǎn)量，指標(biāo)越大越好，所以應(yīng)該選取每個(gè)因素的 K1j、 K2j、 K3j中最大的那個(gè)水平。本題中： DBAC,即因素的影響程度為：氯化鋰使用方法＞超聲波誘變時(shí)間 ＞超聲波功率＞氯化鋰濃度。極差越大，說(shuō)明這個(gè)因素的水平的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越大。在正交實(shí)驗(yàn)中，氯化鋰濃度分別選 %、 %、 %三個(gè)水平，并分別采用兩種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一種方法能取得比較好的致死效果，可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)的過(guò)程中，培養(yǎng)基中始終有氯化鋰存在，對(duì)紅色糖多胞菌起著長(zhǎng)期誘變的作用，因此誘變效果更好。 （ 2）僅 LiCl誘變法定水平 Licl誘變法定水平的實(shí)驗(yàn)采用兩種方法：一是在培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鋰；二是用不同濃度的氯化 鋰處理孢子后在培養(yǎng)。 超聲波功率分別為 200W、 300W、400W，誘變時(shí)間分別為 0min、 3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 18min、 2min、24min、 27min、 30min。 B．發(fā)酵罐培養(yǎng) 種子培養(yǎng) 的步驟與搖瓶培養(yǎng)相同， 發(fā)酵培養(yǎng) 就是將上面培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種于 3L發(fā)酵罐自動(dòng)發(fā)酵， 同時(shí) 控制發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、 PH、 接種量、攪拌速度和溶解氧等條件，培養(yǎng) 16h。 30000r/min培養(yǎng) 4856h轉(zhuǎn)入二級(jí)種子瓶 30000r/min 繼 7 續(xù)培養(yǎng) 2630h，發(fā)酵培養(yǎng)將上培養(yǎng)好的二級(jí)種子接種于發(fā)酵瓶， 30000r/min 培養(yǎng) 16h。提取方法是在乙酸丁酯及 水溶液（乙酸緩沖液）中反復(fù)萃取。 紅霉素的提取 紅霉素分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)二甲基氨 基官能團(tuán)，是一個(gè)弱堿，在酸性條件下與某些酸會(huì)形成鹽，如紅霉素乳酸鹽。經(jīng)過(guò)預(yù)處理的發(fā)酵液便可進(jìn)行過(guò)濾去除菌絲體及沉淀的蛋白質(zhì)。因?yàn)榱蛩徜\呈酸性，為了防止紅霉素局部酸解而被破壞，我們一般要用 NaoH來(lái)調(diào)節(jié) pH值。尤以蛋白質(zhì)和油等的存在，在溶媒萃取時(shí)將產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象。在發(fā)酵期間每隔一定時(shí)間也要取樣進(jìn)行分析、鏡檢及無(wú)菌試驗(yàn)，檢測(cè)生產(chǎn)狀況，分析或控制相關(guān)參數(shù)。發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制發(fā)酵溫度、發(fā)酵液還原糖量、 pH值、溶氧量及發(fā)酵液粘度等，以便紅色糖多孢菌能夠大量合成紅霉素并排至胞外。 試驗(yàn)儀器 試管，移液管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，燒杯，錐形瓶，量筒，堿式滴定管，酸式滴定管，膠頭滴管，蒸發(fā)皿，石棉網(wǎng)，小漏斗，試管架，試管夾 ，漏斗，漏斗架 ； 電子天平 (FA2104；上海恒平科學(xué)儀器有限公司 )； 分光光度計(jì) (VIS7220N；北京瑞利分析儀器公司 )； 電熱恒溫水浴鍋 (GSY10；北京市醫(yī)療設(shè)備廠 )； 臺(tái)式高速離心機(jī) (TGL20；武漢中科儀器發(fā)展有限公司 )； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (RE5299；上海亞榮生化儀器廠 )； 索氏提取器 (SXT02；上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司 )； 6 凱式定氮裝置 (SBD100；北京市通潤(rùn)源機(jī)電技術(shù) 有限公司 )； 調(diào)溫電爐 (SXL1200；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司 )； 酸度計(jì) (MP9000；上海大恒光學(xué)精密機(jī)械有限公司 )； 水浴鍋 (DZKW)， 100 mL 三角瓶 ， 10 mL 刻度吸管， 25 mL 刻度吸管，酸式滴定管， 100 mL 容量瓶， 250 mL 錐形瓶， 大試管： 9 支，容量瓶： 50 mL2 ，刻度吸管： 1 mL3 ， 2 mL1 ，5 mL1 。首選于軍團(tuán)菌肺炎、支原體肺炎、白喉帶菌者、沙眼衣原 體所致的嬰兒肺炎及結(jié)腸炎；也可用于扁桃體炎、中耳炎、鼻竇炎、大葉性肺炎等。 紅霉素的藥理作用 類似芐青霉素，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有強(qiáng)大抗菌作用，包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、白喉棒狀桿菌及梭狀芽孢桿菌；對(duì)革蘭陰性菌如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌、百日咳鮑特菌、布魯菌有較強(qiáng)作用；對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體也有作用。 紅霉素的性狀 紅霉素為白色或類白色的結(jié)晶或 粉末 ；無(wú)臭，味苦；微有引濕性。這類抗生素結(jié)構(gòu)具有聚烯酮衍生的，被一內(nèi)酯鍵閉合的大環(huán)內(nèi)酯骨架，并通過(guò)羥基以糖苷鍵聯(lián)結(jié) 1～ 3個(gè)罕有的中性或堿性糖。紅霉素在臨床上的應(yīng)用也很廣泛， 主要用于呼吸道感染、皮膚與軟組織感染、泌尿生殖系統(tǒng)感染及胃腸道感染等。 紅霉素 是國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最廣的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素之一 。紅霉素堿能和有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸類結(jié)合成鹽，其鹽類易溶于水 [7]。紅霉素熔點(diǎn)為 135～ 140℃ （游離堿水合物）， 190～ 193℃ （無(wú)水游離堿）。在水中的溶解度為 2mg/ml（ 25℃ 左右），它隨著溫度的升高而減少。 紅霉素簡(jiǎn)介 紅霉素是 1952 年從紅色鏈霉菌培養(yǎng)液中分離出來(lái)的一種 14 元環(huán)大環(huán)內(nèi)醋類堿性抗生素。發(fā)酵過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生某些雜質(zhì)，通過(guò)簡(jiǎn)單的預(yù)處理可能很難完全去除，會(huì)導(dǎo)致紅霉 A、 B、 C的分離效果不好，而常用的預(yù)處理方法在萃取紅霉素時(shí)又會(huì)造成很大損失。歐洲藥典規(guī)定在紅霉素產(chǎn)品中 ErB的含量不能超過(guò) 5%。在發(fā)酵過(guò)程中，盡管對(duì)環(huán)境的參數(shù)，如發(fā)