【正文】 的變色圈還可以快速分離篩選產(chǎn)乙醇的菌株。 分離內(nèi)肽酶產(chǎn)生菌，除了用酪蛋白作底物平板產(chǎn)生透明圈進(jìn)行鑒別外，還可以用吲羥乙酸酯為底物加到分離培養(yǎng)基中，產(chǎn)生蛋白酶的菌落由于水解吲羥乙酸酯為3羥基吲哚，后者能氧化生成藍(lán)色產(chǎn)物，根據(jù)呈色圈便可選出平板上產(chǎn)蛋白酶的菌落。后來(lái)又由Fryer等研究出一種改良的雙層法，先在平皿內(nèi)倒一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，把一張棉紙圓片在被維多利亞藍(lán)染了色的乳脂中浸濕，鋪在已凝固的瓊脂表面，然后覆蓋一薄層含樣品的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，保溫培養(yǎng)，解脂菌落就可以在棉紙中產(chǎn)生藍(lán)帶。最常使用的方法是把惡秦染料中的維多利亞藍(lán)和脂類底物混合，制成維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基平板，起始培養(yǎng)基調(diào)為中性，當(dāng)土壤樣品的懸濁液分離在平板上，具有脂解能力的 菌落產(chǎn)生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，陽(yáng)性解脂反應(yīng)能顯示粉紅到藍(lán)色的變化。 在進(jìn)行解脂微生物的分離時(shí)，雖然有很多精確的測(cè)定方法，如酸堿滴定法、電位滴定法、濁度滴定法、甘油滴定法及色譜分析法等，但由于步驟繁瑣，不適于大規(guī)模篩選測(cè)定。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時(shí)，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍(lán)，它是一種酸堿指示劑，～。 對(duì)于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來(lái)。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進(jìn)行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來(lái)。如要分離該酸水解酶產(chǎn)生菌，可用雙層平板法，首先在普通平板培養(yǎng)基上把懸浮液涂抹培養(yǎng)，等長(zhǎng)出菌落后覆蓋一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，內(nèi)含3%酵母RNA，%，于42℃左右培養(yǎng)2～4h,四周產(chǎn)生透明圈的菌落，即為核酸分解酶產(chǎn)生菌。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時(shí)采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會(huì)在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。 在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。分離培養(yǎng)基是根據(jù)目的微生物特殊的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來(lái)設(shè)計(jì)的。這種方法有時(shí)分離不夠充分，可用劃線法進(jìn)一步純化。第二種方法，取風(fēng)干粉末狀的土樣少許（幾十毫克）直接灑在選擇性分離培養(yǎng)基平板上或混入培養(yǎng)基中制成平板，置適溫培養(yǎng)一定時(shí)間，長(zhǎng)出菌落。 在樣品含菌量較少或某種目的微生物不多的情況下，微生物的純種分離方法可以簡(jiǎn)化如下：第一種方法，取一支盛有3～5ml無(wú)菌水的粗試管或小三角瓶，取混勻的樣品少許（）放入其中，充分振蕩分散，用滅菌滴管取一滴土壤懸液于瓊脂平板上涂抹培養(yǎng)，或者用接種環(huán)接一環(huán)于平板上劃線培養(yǎng)。（二）劃線分離法 用接種環(huán)取部分樣品或菌體，在事先已準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基平板上劃線，當(dāng)單個(gè)菌落長(zhǎng)出后，將菌落移入斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后備用。土壤樣品的稀釋程度，要看樣品中的含菌數(shù)多少，一般有機(jī)質(zhì)含量高的菜園土等，樣品中含菌量大，稀釋倍數(shù)高些，反之稀釋倍數(shù)低些。 下面對(duì)這幾種分離純化方法分別加以介紹。另一類是較細(xì)的單細(xì)胞或單孢子分離方法，可達(dá)到“菌株純”或“細(xì)胞純”的水平。前兩種方法由于操作簡(jiǎn)便有效，工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較多。因此，經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)后的樣品，也需要進(jìn)一步通過(guò)分離純化，把最需要的菌株直接從樣品中分離出來(lái)。富集后的培養(yǎng)液中仍然有多種微生物混雜在一起，即使占了優(yōu)勢(shì)的一類微生物中，也并非純種。 但是如果按通常分離方法，在培養(yǎng)基平板上能出現(xiàn)足夠數(shù)量的目的微生物，則不必進(jìn)行富集培養(yǎng)，直接分離、純化即可。分離耐高濃度酒精和高滲酵母菌時(shí)，可分別將樣品在高濃度酒精和高濃度蔗糖溶液中處理一段時(shí)間，殺死非目的微生物后再進(jìn)行分離。另外據(jù)報(bào)道，重鉻酸鉀對(duì)土壤真菌、細(xì)菌有明顯的抑制作用，也可用于選擇分離放線菌。分離厭氧菌時(shí)，可加入少量硫乙醇酸鈉作為還原劑，它能使培養(yǎng)基氧化還原電勢(shì)下降，造成缺氧環(huán)境，有利于厭氧菌的生長(zhǎng)繁殖?？上葘⑼翗蛹訜岬?0℃或在50%乙醇溶液中浸泡1h，殺死不產(chǎn)芽孢的菌種后再進(jìn)行分離。三、抑制不需要的菌類 在分離篩選的過(guò)程中，除了通過(guò)控制營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件，增加富集微生物的數(shù)量以有利于分離外，還可通過(guò)高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，同樣能夠達(dá)到富集的目的。因嚴(yán)格厭氧菌不僅可省略通氣、攪拌裝置，還可節(jié)省能耗。篩選極端微生物時(shí)，需針對(duì)其特殊的生理特性，設(shè)計(jì)適宜的培養(yǎng)條件，達(dá)到富集的目的。因此，富集培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)到被分離微生物的要求范圍不僅有利于自身生長(zhǎng)，也可排除一部分不需要的菌類。二、控制培養(yǎng)條件 在篩選某些微生物時(shí)，除通過(guò)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的選擇外，還可通過(guò)它們對(duì)pH、溫度及通氣量等其他一些條件的特殊要求加以控制培養(yǎng)，達(dá)到有效的分離目的。連續(xù)富集培養(yǎng)的方法雖耗時(shí)較長(zhǎng)，有時(shí)甚至需要6～7個(gè)月，但效果較好。同時(shí)錐行瓶壁上也可觀察到微生物的生長(zhǎng)情況。移種的時(shí)間既可根據(jù)底物的降解情況，也可通過(guò)微生物的生長(zhǎng)情況確定。如以苯胺作惟一碳源對(duì)樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)，待底物完全降解后，再以一定接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含苯胺的富集培養(yǎng)液中，如此連續(xù)移接培養(yǎng)數(shù)次。在配制時(shí)要特別注意酵母浸膏加量，過(guò)多會(huì)刺激菌絲生長(zhǎng)，而不利于孢子的產(chǎn)生。富集培養(yǎng)基為5%～6%的麥牙汁，30%～40%葡萄糖，pH3～4，在20～25℃溫度下進(jìn)行培養(yǎng)，可以達(dá)到富集的目的。又如要分離耐高滲酵母菌，由于該類菌在一般樣品中含量很少，富集培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件必須嚴(yán)密設(shè)計(jì)。能分解利用該底物的菌類得以繁殖，而其他微生物則因得不到碳源無(wú)法生長(zhǎng)，菌數(shù)逐漸減少。富集培養(yǎng)基的選擇性只是相對(duì)的，它只是微生物分離中的一個(gè)步驟。那些能分解利用的菌株因得到充足的營(yíng)養(yǎng)而迅速繁殖，其他微生物則由于不能分解這些物質(zhì)，生長(zhǎng)受到抑制。如果環(huán)境中含有較多某種物質(zhì)，則其中能分解利用該物質(zhì)的微生物也較多。一般可從以下幾個(gè)方面來(lái)進(jìn)行富集。含微生物樣品的富集培養(yǎng) 富集（enrichment）培養(yǎng)是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在最適的環(huán)境下迅速地生長(zhǎng)繁殖，數(shù)量增加，由原來(lái)自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需要的菌株。 第二節(jié)有人從溫泉和海底火山口分離出了極端嗜熱菌。嗜堿菌中的基因還可以用來(lái)調(diào)節(jié)其他細(xì)菌中基因產(chǎn)物的表達(dá)和分泌。由于大部分堿湖伴有高鹽，許多嗜堿菌同時(shí)也是嗜鹽菌。通常在pH9～10之間的微生物，稱之為嗜堿菌（alkaliphiles）。主要分布于寒冷的環(huán)境中，如南北兩極地區(qū)、冰窟、高山、深海和土壤等低溫環(huán)境中。生活所處的特殊環(huán)境，導(dǎo)致它們具有不同與一般微生物的遺傳特性、特殊結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能，因而在冶金、采礦及生產(chǎn)特殊酶制劑方面有著巨大的應(yīng)用價(jià)值。2．極端環(huán)境條件的影響 微生物一般在中溫、中性pH條件下生長(zhǎng)。從考拉(Koala)熊腸中也曾分離到萜烯分解酶的產(chǎn)生菌，這可能因?yàn)榭祭瓕３院懈咻葡┑蔫駱漕愔参铮o該種微生物創(chuàng)造了一個(gè)適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。如得克薩斯州中南部的一個(gè)巖洞中存在著大量嗜堿性的，能進(jìn)行氨氧化和產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物，其原因是這里生活這2000萬(wàn)只蝙蝠，它們每晚吃釣5萬(wàn)lb（磅）昆蟲，其排泄物造成了洞內(nèi)0m深的豐富營(yíng)養(yǎng)層，這種特殊的環(huán)境對(duì)該種微生物起了選擇和富集的作用。從海洋中采樣時(shí)，可參考其中不同種類微生物的分布規(guī)律：表層多為好氣異養(yǎng)菌，底層由于有機(jī)質(zhì)豐富，硫化氫含量高，厭氣性腐敗菌和硫酸鹽還原菌較多，兩層中則多為紫硫菌。筆者從鱈魚腸道中分離到一株pj20細(xì)菌，在15℃%。此外，美國(guó)馬里蘭大學(xué)也曾從海綿體內(nèi)的共生或共棲的細(xì)菌中分離到抗白血病、鼻咽癌的抗癌物質(zhì)。 海洋對(duì)于微生物來(lái)說(shuō)是一個(gè)特殊的局部環(huán)境，盡管許多微生物也是經(jīng)河水、污水、雨水或塵埃等途徑而來(lái)，但由于海洋獨(dú)特的高鹽度、高壓力、低溫及光照條件，使海洋微生物具備特殊的生理活性，相應(yīng)也產(chǎn)生了一些不同于陸地來(lái)源的特殊產(chǎn)物。但在該地區(qū)的溫泉或堆肥中，卻會(huì)出現(xiàn)為數(shù)眾多的高溫微生物。三、特殊環(huán)境下采樣1．局部環(huán)境條件的影響 值得注意的是微生