【正文】 璃瓶內(nèi) 4℃冰箱低溫保藏（共 24瓶） 。無花果曲霉() 菊粉酶經(jīng)純化得到三種酶 :外切酶 I、外切酶 II 和內(nèi)切酶 I，三種酶分子量分別為 42,900Da、43,400Da 、47,200Da 。而 pH 時胞外無菊粉酶 [20]。(3)無機(jī)磷源的影響在培養(yǎng)基中加入磷源 NaH2PO4 %和 KH2PO4 %，產(chǎn)酶活力比不加磷源高 [6]。Fontana 等人用菊粉的衍生物己酸化菊粉和膽固醇菊粉作碳源，發(fā)現(xiàn)己酸化菊粉是最好的誘導(dǎo)物，其酶活比用菊粉作誘導(dǎo)物提高了 419816 倍 [10]。Nakamuar 等人詳細(xì)描述了篩選用的培養(yǎng)基及篩選過程，傳統(tǒng)的篩選培養(yǎng)基為：菊粉 %，K 2HPO4 %，MgS0 4`%，NaN0 3 %， (NH4)H2PO4 %，KCl %，F(xiàn)eSO4(4)其他方面應(yīng)用菊粉酶還可直接發(fā)酵菊粉制備各種產(chǎn)品，如可制備丙酮丁醇，用于診斷腎臟疾病，控制血糖升高。菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿的研究國內(nèi)外都較多，我國對其研究還處于起步狀態(tài) [9]。提高菊粉酶酶解效率的關(guān)鍵在于提高酶活和增加底物對酶作用的敏感性。(2)根據(jù)作用底物方式的不同，或者說根據(jù)菊粉酶酶切果聚糖鏈方式分為內(nèi)切酶和外切酶。進(jìn)一步篩選性能優(yōu)良的菊粉酶高產(chǎn)菌仍舊十分重要。：耐低溫菊粉酶產(chǎn)生菌的分離及發(fā)酵條件優(yōu)化研究外文題目：ISOLATION OF LOWTEMPERATURERESISTANT INULINASE PRODUCING STRAIN AND OPTIMIZATION OF FERMENTATION CONDITIONS 畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）共 50 頁（其中：外文文獻(xiàn)及譯文 23 頁）圖紙共 0 張 完成日期 2022 年６月 答辯日期 2022 年 6 月摘要在如今物質(zhì)豐富，人們注重營養(yǎng)保健的年代，菊粉酶作為一種能將菊粉降解為高純度果糖或低聚果糖的酶制劑，其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)越來越受到科研界及商業(yè)界的重視。生物學(xué)研究始于 90年代的工程菌還未構(gòu)造成功，關(guān)于菊粉酶分子至今具有生產(chǎn)意義。 菊粉酶的分類(1)根據(jù)菊粉酶在微生物體內(nèi)主要分布于細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞壁和細(xì)胞外，分別稱為胞內(nèi)酶、胞壁結(jié)合酶和胞外酶，比例主要受菌種、碳源、溫度和 pH 的影響：，另兩種酶比例上升；，前者胞外酶比例高于后者，其他兩種酶則相反；，細(xì)胞壁結(jié)合酶主要產(chǎn)自酵母； pH 使細(xì)胞壁通透性增大，提高了胸外酶比例，其他兩種酶比例下降。這可能是因?yàn)樘崛∫撼辗弁猓€含有較多的短鏈的多聚果糖，更有利于菌體的生長以及被酶水解。外切菊粉酶降解產(chǎn)物以果糖為主且果糖比例高。發(fā)酵粗菊芋提取液，不需加其他營養(yǎng)物質(zhì)，25h 內(nèi)酒精產(chǎn)量 %[10]。 產(chǎn)菊粉酶菌種的分離篩選產(chǎn)菊粉酶的菌種一般可以從菊芋或菊芋腐爛的根際土壤中的微生物利用以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基上分離篩選出來。Thonart研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘油、乙醇對經(jīng) NTG 誘變過的菌株有誘導(dǎo)作用，而對野生菌株無誘導(dǎo)作用 [9]。在無機(jī)氮源中，以(NH 4)2HPO4和（NH 4)H2PO4 作氮源產(chǎn)酶量最高，(NH 4)2SO4，NH 4C1，NH 4NO3 和 KNO3 也能促進(jìn)產(chǎn)酶量提高 [6]。培養(yǎng)條件也影響菊粉酶的分布，對于克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)以 pH 影響最大，低 pH 高溫下有利于菊粉酶釋放于胞外，pH ,35℃下培養(yǎng)時，胞外有菊粉酶。 菊粉酶的性質(zhì)不同菌種所產(chǎn)菊粉酶的性質(zhì)有所不同。2 材料與方法 樣品 腐爛的菊芋，保藏于生化實(shí)驗(yàn)室 4℃的冷柜中； 培養(yǎng)基(1)斜面保藏培養(yǎng)基：牛肉膏 %，蛋白胨 1%，氯化鈉 %，瓊脂 %，pH 調(diào)至；(2)分離培養(yǎng)及：(NH 4)2SO4 %，MgSO 4 發(fā)酵條件優(yōu)化研究(1)PlackettBurmen 試驗(yàn)利用 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)從豆粕添加量、菊粉添加量、硫酸銨添加量、初始 pH 值、磷酸氫二鉀添加量、吐溫添加量、氯化鈣添加量、氯化鎂添加量這 8 個在發(fā)酵過程中影響菊粉酶活力的相關(guān)因素中，選出主要影響因素。/%1 +1 因素水 平 1 0 1豆粕/A % % %初始 pH/B 氯化鈣/C % % %(2)果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定取 7 支有編號的 25mL 刻度試管，依次加入 lmg/mL 的果糖標(biāo)準(zhǔn)液、 和 ，后又依次向其中分別加入蒸餾水 、 和 ，之后依次加入 ,5二硝基水楊酸試劑，將各管搖勻，在沸水浴中加熱 5min，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻，再用蒸餾水定量至 25mL，用橡皮塞塞住管口，顛倒混勻，在540nm 下測定吸光度，用 0 號調(diào)零，分別讀取 16 號管的吸光度，以果糖濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算公式： ?8Nx— 反應(yīng)液加入 蒸餾水后其果糖含量 (mg/mL)x4— 反應(yīng)液稀釋到 2mL，濃度變?yōu)樵瓉淼?1/45—1mL 稀釋后的粗酶液加 2%的菊粉溶液，相當(dāng)于稀釋到 ，濃度變?yōu)樵瓉淼?2/3N—粗酶液稀釋倍數(shù)180/1000—1mg 果糖的 μmol 數(shù)30—反應(yīng)時間 30min 圖 22 果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 22 fructose standard curve3 結(jié)果與分析 菌種分離將采集到的樣品進(jìn)行菌種分離，得到最適稀釋度為 105，分離結(jié)果如圖 31 所示。因此，菊粉酶產(chǎn)量最主要的影響因子為豆粕添加量(X 1)、初始 pH 值(X 5)和氯化鈣添加量 (X8)，選取他們?yōu)檠芯繉ο?，作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。同時，軟件分析得到模型的決定系數(shù) R2=，說明菌種發(fā)酵產(chǎn)菊粉酶活力所考察的 3 個因素中，僅有 %試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性不能由該模型來解釋，表明該模型能夠很好地反映試驗(yàn)的真實(shí)情況。(4)試驗(yàn)驗(yàn)證根據(jù)響應(yīng)面分析得到菌種發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳工藝參數(shù)為：豆粕添加量 %、初始 pH值 、氯化鈣添加量 %。 進(jìn)行酶活力測定時的影響因素本試驗(yàn)在進(jìn)行酶活力測定時需要用到恒溫水浴鍋來保持酶反應(yīng)的最適溫度 50℃，在進(jìn)行酶解反應(yīng)前，不能僅根據(jù)水浴鍋的數(shù)字顯示判斷其溫度已穩(wěn)定在 50℃，因?yàn)槠浼訜崦嬖阱伒撞?，溫度感?yīng)板也在鍋底部，所以剛開始加熱時其下層水的溫度必然要高于上層水的溫度，且板底部由于加熱的原因，必然溫度高于 50℃，因此需用溫度計(jì)測量其中部水溫，并待其一定時間內(nèi)（一般 3~5min）溫度保持穩(wěn)定后在進(jìn)行試驗(yàn)；并且由于反應(yīng)過程中，水浴鍋內(nèi)隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水不斷蒸發(fā)散熱，使其溫度不能穩(wěn)定的維持在 50℃，所以，試驗(yàn)過程中要盡量密封開口處，使散熱減少；酶解反應(yīng)的時間要做到統(tǒng)一 5min，最好一次將試驗(yàn)組全部做完，同時開始反應(yīng)并同時結(jié)束，避免由于時間不統(tǒng)一而造成數(shù)據(jù)不科學(xué)，不可信；酶反應(yīng)階段結(jié)束后，要立即進(jìn)行沸水浴加熱滅火，避免酶對底物的后續(xù)反應(yīng)；在定容測吸光度值時，要迅速用冷水將混合液冷卻后再定，避免由于液體體積熱脹冷縮，造成定容不準(zhǔn)，影響吸光度值的準(zhǔn)確性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與相關(guān)研究的比較本試驗(yàn)分離篩選出的菊粉酶高產(chǎn)菌株通過 PlackettBurmen 試驗(yàn)從豆粕添加量，菊粉添加量，(NH 4) 2SO4 添加量，磷酸氫二鉀添加量，吐溫添加量，氯化鎂添加量，初始 pH值，氯化鈣添加量這 8 個因子中篩選出影響發(fā)酵過程中菊粉酶活力的主要因素，即為豆粕添加量、初始 pH 值及氯化鈣添加量，再通過設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)探究其最優(yōu)發(fā)酵條件為：豆粕添加量 %，菊粉添加量 2%，(NH 4)2SO4 %，磷酸氫二鉀 %，吐溫 %，氯化鎂 %，初始 pH 值 ，氯化鈣添加量 %；得到的此最佳發(fā)酵條件下的酶活力為 。 圖 33 豆粕添加量和初始 pH 交互影響菊粉酶活性響應(yīng)面圖 Response surface graph of reciprocal effects of bean pulp and initial pH 圖 34 豆粕添加量和 CaCl2 添加量交互影響菊粉酶活性響應(yīng)面圖 Response surface graph of reciprocal effects of bean pulp and CaCl2 圖 35 初始 pH 和 CaCl2 添加量交互影響菊粉酶活性響應(yīng)面圖 Response surface graph of reciprocal effects of initial pH and CaCl2(3)最優(yōu)響應(yīng)值分析為確定各因素的最佳取值，根據(jù)回歸方程存在極值的必要條件，即 Y 分別對X1，X 2，X 3 求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為零，得出方程組，再解方程組即可。17 個試驗(yàn)分為析因點(diǎn)和零點(diǎn)，試驗(yàn)號 1~12 是中心試驗(yàn),零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù) 5 次，以估計(jì)試驗(yàn)誤差。表 31 33 株菊粉酶產(chǎn)生菌菌株酶活力測定結(jié)果表Table 31 The enzyme activity determination result table of 33 strains inulin enzyme bacteria strains 菌株號 酶活力/U 菌株號 酶活力/U1 18 2 19 3 20 4 21 5 22 發(fā)酵條件優(yōu)化研究 PlackettBurman 試驗(yàn)選用 N=12 的 PlackettBurman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對豆粕添加量、菊粉添加量、硫酸銨添加量、初始 pH 值、磷酸氫二鉀添加量、吐溫添加量、氯化鈣添加量、氯化鎂添加量 8 個影響菊粉酶活力的相關(guān)因素進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表 32。取 濃度為 2%的菊粉溶液 (用 pH 值 的醋酸鈉緩沖液配制)，50℃下水浴中預(yù)熱 2min，加入 1mL50℃下預(yù)熱的粗酶液（或稀釋后的酶液，要試驗(yàn)稀釋幾倍能使吸光度在 范圍內(nèi)） ，50℃ 條件下反應(yīng)反應(yīng) 30min，沸水浴中5min 滅活，取 反應(yīng)液，加入 蒸餾水和 DNS，混勻，沸水浴中反應(yīng)5min，迅速冷卻并定容至 25mL，在 540nm 處，測定其吸光度 A。針對所得數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，得出相對應(yīng)的各個因素顯著性，由此確定哪些試驗(yàn)因素對于菊粉酶發(fā)酵過程起到主要影響作用，并對這些顯著影響因素的顯著性進(jìn)行排序。(5)活化將保藏菌種轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28℃下恒溫培養(yǎng) 1d，再轉(zhuǎn)接于斜面