【正文】 培養(yǎng)基中，35℃， 180r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng) 1d，如此連續(xù)活化兩次，備用。黑曲霉() 內(nèi)切菊粉酶分子量 ，只水解菊粉不水解蔗糖，最適溫度為45℃， 40℃以下穩(wěn)定， 50℃以上開始失活，80℃時完全失活，最適 pH ，pH 時酶活為 100%pH 時酶活為 76%，pH 時酶活為 51%，pH 時酶完全失活 [5]。離子交換層析可用來選擇性地分離外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶，通常用 NaCl 進行線性梯度洗脫，隨著 NaCl 濃度增加，內(nèi)切菊粉酶先洗出，外切酶后洗出。克魯維酵母(Kluyveromyces waltii)產(chǎn)酶的最適溫度為 3040℃[21]。也有人認為菊粉酶是組成型酶，當馬克斯克魯維酵母()在以甘油作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長時也產(chǎn)菊粉酶。Viswanathan 等人通過對黑曲霉(Aspergillus niger)進行紫外誘變，使菌體產(chǎn)酶活力提高 3 倍 [11]。 研究現(xiàn)狀 產(chǎn)菊粉酶的微生物菌種大多數(shù)微生物菊粉酶均為外切型菊粉酶，并且常常呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)化酶活力，轉(zhuǎn)化酶是一種水解蔗糖為葡萄糖和果糖的酶，對菊粉沒有作用。中國食品發(fā)酵研究所、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所等已經(jīng)試制成功，正在擴大試驗中。 菊粉酶的生產(chǎn)應用(1)利用菊粉酶生產(chǎn)高果糖漿高果糖漿價格低廉，味甜，爽口，滲透壓高，保藏效果好，熱值低，不易造成齲齒，而且糖尿病患者可利用，所以在美、日等發(fā)達國家被廣泛用于食品和醫(yī)藥工業(yè) [15]。內(nèi)切菊粉酶水解菊粉可以得到高純度低聚果糖，常由真菌分離出來。利用菊粉酶直接水解菊粉(或菊芋汁)生產(chǎn)果糖或超高果葡糖漿(UHFGS)己顯示出巨大的工業(yè)應用潛力，UHFGS 果糖含量為 90%95%，而目前普遍采用的利用淀粉生產(chǎn)的果葡糖漿僅含 42%45%的果糖，不僅轉(zhuǎn)化率低，而且工藝復雜。關鍵詞：菊粉酶；高產(chǎn)菌株；發(fā)酵條件優(yōu)化AbstractIn the era of material abundance,people pay more attention to nutrition and health,inulinase as a Enzyme preparation which can degradate inulin to high purity fructose or lowmolecularweight fructos,it largescale production attract more and more attention by the research munity and the business present foreign study so much on microbial inulinase , including strains isolation, fermentation conditions and the nature of the enzyme, our studies on inulinase is still stuck in the laboratory stage, due to the low yield of enzyme and high production costs,it not yet industrialized application. Therefore, further screening of excellent performance, highyield enzyme strains are still very important.The study separation lowtemperatureresistant inulinase producing strains from the decayed artichoke kept at low temperature ,screening high yield inulin enzyme strains from the 33 strains by the method of DNS colorimetric,and the result show that 2nd strain enzyme is the highest yield Inulin enzyme ,enzyme activity lead to 。Screening the main factor that affect inulinase activity in the fermentation process by PlackettBurmen test from soybean pulp addition,inulin addition,(NH4)2SO4 addition,K2HPO4 addition,Twain addition,MgCl addition,initial pH,CaCl2 addition,and the main factors are soybean pulp addition,initial pH and CaCl2 addition,Design response surface methodology explore the optimal fermentation conditions as follows:corn syrup %,inulin 2%,(NH4)2SO4 %,dipotassium hydrogen phosphate %,tween80 %,magnesium chloride %, the initial pH value of ,calcium chloride %。利用果糖或 UHFGS 替代蔗糖或果葡糖漿在食品工業(yè)上應用，能避免由蔗糖、葡萄糖引起的齲齒、高血壓、糖尿病等副作用。外切菊粉酶在胞內(nèi)、胞壁、胞外都有分布，它水解菊粉可以得到高純度果糖。20 世紀 70 年代后，各國開始以菊粉為原料，以酸法和酶法水解制備果糖。工業(yè)上生產(chǎn)利用菊粉酶生產(chǎn)低聚果糖的方法是由內(nèi)切型菊粉酶水解菊粉而成，產(chǎn)物以低聚果糖為主，純度高，原料便宜，低聚果糖已被視為食品原料，而非食品添加劑 [10]。產(chǎn)菊粉酶的微生物包括真菌、酵母和細菌。Nakamura 等人對黑曲霉 (A .niger)進行 60Co 誘變得到誘變菌酶活 /mL，比野生菌提高了 4 倍；I/S 為 880，是野生菌的 16 倍 [9]。(2)氮源的影響在不同的培養(yǎng)條件下，對于不同菌株，氮源的影響也不同。真菌達到最大生長量和最高酶活的溫度范圍為 2734℃，如黑曲霉(Aspergillus niger) 的最適產(chǎn)酶溫度為 30℃，青霉菌(Penici1lium )為 3033℃[12]。有些微生物菊粉酶不宜用(NH) 2SO4 沉淀如 var 菊粉酶用(NH) 2SO4 沉淀易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷凍干燥 [14]。外切酶的反應機理為單鏈反應，以菊粉為底物，以葡萄糖的生成速度、果糖與葡萄糖之比的變化速度為依據(jù)來判斷，水解反應一般為單鏈反應，即一次只水解一條鏈；pH對此作用機制有影響， 時，較多地傾向于多鏈反應， pH 時為單鏈反應 [18]。(6)擴大培養(yǎng)將活化好的菌種轉(zhuǎn)接于 50mL 裝（250mL 三角瓶）的種子培養(yǎng)基中，28℃，180r/min搖床下培養(yǎng) 1d；(7)接種發(fā)酵按實驗設計的發(fā)酵條件，以 3%的接種量從種子培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接于 50mL 裝（250mL 三角瓶）的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；(8)酶活力測定具體操作參考本論文 菊粉酶活力的測定方法； 研究內(nèi)容 菌種分離取一定量冰箱中保藏的樣品，置于含無菌水和玻璃珠的三角瓶中，將樣品進行充分振蕩分散后，涂布到以菊粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫培養(yǎng) 1d,選擇菌落分散程度適宜的平板，將對應的稀釋度作為最適稀釋度，重復上述操作過程，以最適稀釋度進行稀釋涂布，得到一定量的分離結(jié)果，待菌種篩選備用。表 23 PlackettBurman 試驗因素水平及編碼Table 23 Factors level and coding in PlackettBurman test因素X1 豆粕/%X2 菊粉/%X3 空白項X4 硫酸銨/%X5 初始 pHX6 磷酸二氫鉀X7 吐溫80/%X8 氯化鈣/mMX9 空白項X10 氯化鎂/mM(2)響應面優(yōu)化試驗根據(jù) BoxBenhnken 的中心組合試驗設計原理，進一步進行三因素三水平兩次重復的響應面分析試驗，17 個試驗點的設計方案如表 5 所示。在相同條件下，以加入失活的酶液的反應液作對照。表 32 PlackettBurman 試驗篩選主要影響因素Table 8 Variance analysis for PlackettBurman experimental results6 23 7 24 8 25 9 26 10 27 11 28 12 29 13 30 14 31 15 32 16 33 17 試驗號X1 豆粕X2 菊粉/%X3 空白項X4 硫酸銨/%X5 初始pHX6 磷酸二氫鉀/%X7 吐溫80/%X8 氯化鈣/mMX9 空白項X10氯化鎂/mM酶活力/U1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 對 PlackettBurman 試驗結(jié)果進行方差分析，分析結(jié)果如表 33 所示。X9 1 X10 1 模型 10 *誤差項 1 總和 11 因素 水平 1 +1 F 值 PrF 重要性豆粕/X 1 % % 2菊粉/X 2 % % 6硫酸銨/X 4 % % 4初始 PH/X5 3磷酸二氫鉀/X 6 % % 7吐溫80/X 7 5氯化鈣/X 8 % % 1氯化鎂/X 9 % % 8表 35 響應面分析試驗設計及結(jié)果Ta