轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)的分析研究畢業(yè)論文-文庫吧資料
2025-06-28 08:04本頁面
【正文】 ，取出立即加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的2mLB試劑終止酶反應(yīng)。、。 pH對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的影響，吸取1mL酶液，加入到具塞試管中，℃的 2mLA試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min，℃的2mLB試劑終止酶反應(yīng)。然后于525nm波長測定其吸光值，并計(jì)算其酶活力。注：通過查閱文獻(xiàn)可知，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在35℃～40℃之間時(shí)其活力最大，為了能準(zhǔn)確的得出其最大活力時(shí)的溫度，則增加了測定在37℃時(shí)酶的活性。以相同的方法分別測定在35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃條件下的吸光值，并計(jì)算其酶活力。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的性質(zhì)研究 溫度對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活力的影響吸取1mL酶液，加入到具塞試管中在水浴鍋中預(yù)熱至30℃，再加入已經(jīng)預(yù)熱至30℃的2mLA試劑，于30℃的水浴中反應(yīng)10min，取出立即加入已經(jīng)預(yù)熱為30℃的2mLB試劑終止酶反應(yīng)。（7）剝膠與染色電泳結(jié)束后，關(guān)閉電源，從電泳槽中取下凝膠板并卸下硅膠框，用帶細(xì)長針頭的注射器吸滿蒸餾水，將針頭插入凝膠與玻璃板之間，沿玻璃板緩緩移動(dòng)，并緩緩將蒸餾水注入，最后注入少量空氣，取出針頭，將兩玻璃板輕輕揭開取出凝膠板，將之置培養(yǎng)皿中，沖洗膠面后，加入染色液，染色12h。用微量注射器取標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測樣品各15μL分別注入樣品槽內(nèi)的電極緩沖液和凝膠之間的界面上。②轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的處理：在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中加入樣品緩沖液，置沸水浴中加熱3min，取出冷卻至室溫。當(dāng)膠液加到距短玻璃板上沿1cm處為止，然后把梳狀樣品槽模板（1mm）插入膠層頂部，待凝膠聚合后形成相互隔開的點(diǎn)樣凹槽。加水時(shí)，不要擾動(dòng)凝膠液面，避免產(chǎn)生氣泡，保證凝膠能正常聚合，室溫下靜置約3040min，當(dāng)水封層與凝膠面之間出現(xiàn)非常明顯的界面時(shí)，即表示凝膠已聚合完全。將配好的凝膠液沿著凝膠的長玻璃板內(nèi)面緩緩注入，將膠液加到距玻璃板上沿約45cm處為止。在上螺絲時(shí)，要按一定順序一個(gè)一個(gè)逐步擰緊，均勻用力，切勿將玻璃板壓碎，或造成漏液。 表23 SDSPAGE凝膠電泳制膠配方表試劑12%分離膠4%濃縮膠雙蒸水分離膠緩沖液（） 10%SDS200μL50μL30%丙烯酰胺凝膠溶液10%過硫酸銨100μL25μLTEMD20μL5μL?HCl， 總體積20mL5mL（3）灌膠及聚合將凝膠模板的二塊長短不等的玻璃片取出洗凈、晾干、嵌入模子的硅膠框的凹槽中，將玻璃片嵌入凹槽時(shí)，長玻璃片下沿與膠框之間保持23cm距離，而短玻璃板下端完全插入膠框底的槽內(nèi)。脫色液：250mL甲醇和100mL冰醋酸混勻后，定容至1000mL。電極緩沖液：稱取3gTris，1gSDS，用水溶解后，定容至1000mL。10%SDS溶液：取10gSDS溶于80mL雙蒸水中，并輕緩攪拌，再定容至100mL，室溫存放。?HCl，：，用60mL雙蒸水溶解，在用4mol/，然后定容至100mL，4℃保存。具體步驟如下：（1）配制所需要的各種試劑丙烯酰胺凝膠儲備液：，并定容至100mL，過濾后4℃下貯存?zhèn)溆谩?。將底色脫凈的凝膠照相、觀察其分子量。采用不連續(xù)電泳，12%分離膠，4%濃縮膠。將洗脫液隔2管測定其酶活力和蛋白含量，得到轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的洗脫曲線。注意在任何時(shí)候不要使液面低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。自然沉降20min，最后放入略小于層析柱內(nèi)徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時(shí)凝膠被沖起。裝柱：將層析柱垂直固定在鐵架臺上，注意上下不要顛倒；將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約12cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續(xù)裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動(dòng)柱床上層凝膠，以免出現(xiàn)界面。葡聚糖凝膠過濾柱層下的步驟如下：(1)葡聚糖凝膠的預(yù)處理：取5克葡聚糖凝膠（Sephadex100）干粉，浸泡于50mL蒸餾水中充分溶脹（室溫，12h），然后反復(fù)傾斜除去表面的懸浮微粒。將上一步收集到的酶液透析脫鹽濃縮后，取3mL 上樣，（）洗脫，用分部收集器進(jìn)行分部收集，每管約3mL。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶凝膠過濾柱層析 80cm的Sephadex G100層析柱，（）平衡。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的超濾脫鹽及濃縮 將酶液裝入超濾杯，用30KD超濾膜，、來確定相對酶活的最佳操作壓強(qiáng)。TrisHCl緩沖溶液的配制：先取10mL市售鹽酸，加入20mL的蒸餾水，配制成4mHCL溶液。表22 調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計(jì)算表飽和度% 25 354555657585每100mL溶液加硫酸銨克數(shù) 分別測定以上6組上清液及沉淀中的酶活力，并以未加硫酸銨的粗酶液中的酶活力為100%，計(jì)算不同飽和度下上清液及沉淀中的酶相對活力，以硫酸銨的飽和度為橫坐標(biāo)，酶相對活力為縱坐標(biāo)繪制鹽析曲線。取粗酶粉1g，溶于100mL 4℃冰浴的30 mmol/L 醋酸緩沖液()，待完全溶解后備用。 測蛋白含量的方法樣品中蛋白質(zhì)含量的測定取1支具塞試管， mL樣品提取液， mL蒸餾水，5mL考馬斯亮藍(lán)G－250試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號試管做參比，在595 nm波長下比色，記錄吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。蓋上塞子，搖勻。在此就運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)法[13] 測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶中的蛋白含量。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶蛋白含量的測定根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，現(xiàn)已提出多種蛋白質(zhì)定量方法。計(jì)算酶活方法采用經(jīng)驗(yàn)公式如下：酶活（U/mL）= （公式21）A：吸光值：酶的稀釋倍數(shù)10：反應(yīng)10分鐘：參加反應(yīng)體積1單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活力單位定義為：37℃每分鐘產(chǎn)生1μmolL谷氨酸γ單羥肟酸所需酶量（U/mL）。6H2O（）等體積混合。 酶活力的測定方法先配制所需要的試劑A和試劑B。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用L谷氨酸γ單羥肟酸制作。2 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)儀器磁力加熱攪拌器781上海南匯電訊器材廠恒溫磁力攪拌器78HW1杭州儀表電廠電熱恒溫水浴鍋DK98Ⅱ天津市泰斯特儀器有限公司pH計(jì)PHS2F上海精密科學(xué)儀器有限公司低速離心機(jī)DT51北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司可見紫外分光光度計(jì)SP72上海光譜儀器有限公司恒流泵HL1上海滬西分析儀器廠有限公司高溫循環(huán)器GX2005上海比朗儀器有限公司凝膠柱40上海錦華層析設(shè)備廠自動(dòng)部分收集器BS160A上海滬西分析儀器廠有限公司電泳槽DYCZ28A北京市六一儀器廠凝膠電泳儀BGPower 300北京市六一儀器廠高速離心機(jī)TGL16GB北京市六一儀器廠超濾膜30KD上海摩速科學(xué)器材有限公司超濾杯MSC300上海摩速科學(xué)器材有限公司透析袋25KD上海摩速科學(xué)器材有限公司電子萬用爐天津市泰斯特儀器有限公司電子天平ALC2100上海精密儀器儀表有限公司凝膠成像系統(tǒng)tanon 2500上海天翼科學(xué)儀器有限公司 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 實(shí)驗(yàn)材料轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（酶活為1000U）EDTA 分析純 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司 NαCBZGlnGly分析純sigma公司L谷氨酸γ單羥肟酸分析純sigma公司鹽酸分析純北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司考馬斯亮藍(lán)G250分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所考馬斯亮藍(lán)R250分析純天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所聚乙二醇分析純天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司瓊脂糖生化試劑上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司TEMED生化試劑Solarbio公司低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白生化試劑Solarbio公司溴酚藍(lán)生化試劑Solarbio公司β巰基乙醇生化試劑Solarbio公司SDS生化試劑SCIENTIFIC RESEARCH SPECIA LTrisbase生化試劑SCIENTIFIC RESEARCH SPECIAL 實(shí)驗(yàn)方法 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的測定 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶酶活力的測定原理轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶不僅能催化蛋白的谷氨酰胺殘基水解或?qū)氩?，從而釋放出NH3而且也可催化一些含谷氨酰胺?；亩嚯漠a(chǎn)生此類反應(yīng)。再將純化后的酶用SDSPAGE檢驗(yàn)蛋白純度，分析其分離效果，并得出其分子量。本課題通過做一些基礎(chǔ)性的研究，主要是對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行分離純化，并對其性質(zhì)做一定的研究，希望能為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在我國的研究，和以后的工業(yè)化應(yīng)用開辟道路。主要表現(xiàn)在：該酶能提
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