【正文】 含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支具塞試管，編號(hào)后，按21表加入試劑。放置2min后在595 nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定（比色應(yīng)在 l h內(nèi)完成）。表21 繪制考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表操作項(xiàng)目管 號(hào)1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液/mL0 0. 6 蒸餾水/mL 0G250試劑/mL各5蛋白質(zhì)含量/μg0 20 40 60 80 100注：G250考馬斯亮藍(lán)溶液：稱取100mg G250考馬斯亮藍(lán)，加入95%乙醇50mL，再加800mL水，加100mL 85%磷酸，定容至1000mL。根據(jù)所測(cè)樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量（μg），按下式計(jì)算： 樣品蛋白質(zhì)含量（μg／g鮮重）＝（查得的蛋白質(zhì)含量（μg）提取液總體積（mL））／（樣品鮮重（g）測(cè)定時(shí)取用提取液的體積（mL）） 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶分離純化 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶液的制備，定容至1L后。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的硫酸銨分級(jí)沉淀取上述粗酶液，在粗酶液中加入固體硫酸銨至飽和度為35%（見表22），在冰箱中過(guò)夜，離心(8000r/min、10min)后，取上清液加入固體硫酸銨至飽和度為45%，冰箱中過(guò)夜，離心(8000r/min、10min)，在上清液加入固體硫酸銨至飽和度為55%，在冰箱過(guò)夜后，離心(8000r/min、10min)，直到將溶液的飽和度調(diào)到85%為止。以上述測(cè)定結(jié)果選擇適宜的飽和度對(duì)粗酶液進(jìn)行分級(jí)沉淀，酶蛋白沉淀物用TrisHCl緩沖溶液溶解沉淀。()，將Tris溶于200mL水中，加入50mL的4mHCL溶液，定容到100mL容量瓶中。將超濾后的酶取出后裝入透析袋中，用線繩系好后再放入10%的聚乙二醇溶液中濃縮12h，待測(cè)酶活與蛋白質(zhì)含量。調(diào)節(jié)流速至1mL/min。測(cè)吸光度，并繪制洗脫曲線。(2)裝柱長(zhǎng)度至少8cm。以恒流泵控制流速為1mL/min，用磷酸緩沖液洗脫平衡10min。 （3）上樣及洗脫：將柱中多余的溶液放出，待液體降至膠面時(shí)，取透析、濃縮后的酶液5mL，小心加到凝膠柱上，打開管夾，使樣品溶液流入柱內(nèi)，待樣品液面降至膠面時(shí)，加少許洗脫緩沖液將粘附在柱上的殘余樣品洗下，讓其進(jìn)入膠內(nèi)，重復(fù)兩次，打開恒流泵，以1mL/min的速度用洗脫緩沖液洗脫，自動(dòng)部分收集器收集洗脫液1mL/管。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶純度的分析及分子量的測(cè)定　對(duì)所純化的蒜氨酸酶通過(guò)SDSPAGE進(jìn)行分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量推斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分子量。以10mA電流電泳4小時(shí)，用考馬斯亮蘭液染色3h，脫色。濃縮膠貯備液配比為5%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液；分離膠貯備液配比為10%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液。樣品處理液配比為20%的10%SDS溶液，5%的β巰基乙醇，40%的蔗糖，20%溴酚藍(lán)，20%， TrisHCl緩沖液。10%過(guò)硫酸銨：稱取過(guò)硫酸銨1g溶于10mL雙蒸水。?HCl，：稱取6gTris，用60mL雙蒸水溶解，再用4mol/，然后定容至100mL，4℃保存。樣品緩沖液：分別取雙蒸水4mL，?HCl，10%SDS ，%，總體積8mL，4℃保存。染色液：取1g考馬斯亮藍(lán)R250，溶于250mL甲醇及100mL冰醋酸中，溶解后定容至1000mL。（2）配膠按照表23配制所需要的12%分離膠，4%濃縮膠。把裝好的玻璃板的凝膠模子裝入兩個(gè)半槽之間，并注意將較短的玻璃板的一面向著上方有鉑金絲的半槽，或向著連負(fù)極的半槽，然后用螺絲將兩個(gè)半槽固定在一起。電泳槽裝好后，用注射器吸取融化的瓊脂注入背面下槽內(nèi)的小縫中。作水封。此時(shí)用裝有針頭的注射器將水層吸掉，然后沿玻璃板夾縫加入濃縮膠。（4）蛋白質(zhì)樣品的處理①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的處理：取成套的標(biāo)準(zhǔn)蛋白系列加入20μL樣品溶解液，使之充分溶解后置沸水浴中加熱3min，取出冷卻。（5）點(diǎn)樣向上、下槽內(nèi)注入電極緩沖液，上槽緩沖液必須蓋過(guò)短玻璃板。（6）電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開開關(guān)電泳，電流控制在10mA，在整個(gè)電泳過(guò)程中，電流維持不變，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)遷移至距下沿1cm左右，即可停止電泳。（8）脫色染色完畢后，倒出染色液，并換脫色液56次，直至凝膠的藍(lán)色背景褪盡，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止[18]。然后于525nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，并計(jì)算其酶活力。最后以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出酶反應(yīng)的最適溫度。 溫度對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶穩(wěn)定性的影響吸取1mL酶液，加入到具塞試管中，于30℃水浴中保溫120min，取出放置室溫，加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的2mLA試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min，取出立即加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的2mLB試劑終止酶反應(yīng)。以相同的方法將酶分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下保溫后進(jìn)行反應(yīng)，最后分別計(jì)算得出酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。于525nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，并計(jì)算其酶活力。以pH為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出酶反應(yīng)的最適pH值。于525nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值，并計(jì)算其酶活力。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出酶的pH穩(wěn)定性。分別吸取上述溶液1mL于具塞試管中，加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的2mLA試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min，取出立即加入已經(jīng)預(yù)熱至37℃的2mLB試劑終止酶反應(yīng)。以不同離子為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)，作圖，得出不同離子對(duì)酶活力的影響。 圖33 硫酸銨鹽析曲線由圖33可知，在55%飽和度以下，沉淀中的酶活隨飽和度的增加而增加，上清液中的酶活性則隨著飽和度的增加而降低，在55%硫酸銨飽和度下，沉淀酶活性較低，且上清液酶活力較高，故可認(rèn)為沉淀中絕大部分為雜蛋白。故可確定硫酸銨分級(jí)鹽析的飽和度為55%，75%。每個(gè)管中收集的溶液時(shí)間為1min，洗脫時(shí)間與管數(shù)成正比，即洗脫時(shí)間為多少時(shí)，代表所對(duì)應(yīng)的第多少管。圖35 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶凝膠過(guò)濾柱層析曲線由圖35可知，洗脫液中活性較高的部分集中在6375管內(nèi)，其相應(yīng)的蛋白含量也很高，可推斷這部分蛋白為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。從圖中可看出，在第51管和84管上蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)一個(gè)峰值，但是相對(duì)應(yīng)的酶活性并不高，則可推斷該峰是由雜蛋白所產(chǎn)生的。通過(guò)Sephadex G100柱層析，雜蛋白和轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)一步得到分離。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶SDSPAGE檢測(cè)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)純度后，結(jié)果如圖36所示。圖36 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶比活的測(cè)定結(jié)果通過(guò)測(cè)定粗酶和各個(gè)步驟純化后酶的總酶活和總蛋白的值，進(jìn)而計(jì)算得出其比活值。經(jīng)過(guò)超濾后，說(shuō)明通過(guò)超濾截留了一小部分雜蛋白。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶性質(zhì)研究結(jié)果 酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性由圖37所示，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，此時(shí)酶活性最高，但是當(dāng)溫度保持在37℃～45℃之間時(shí)，其酶活性相差不大。圖37 酶最適反應(yīng)溫度 圖38 酶的熱穩(wěn)定性綜合酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性來(lái)看，若想在實(shí)際生產(chǎn)中使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能最大限度的發(fā)揮其活性，并保持有一定的熱穩(wěn)定性，應(yīng)該將其溫度控制在37℃～45℃之間，再?gòu)膶?shí)際節(jié)約成本的角度分析，可將溫度控制在37℃左右，即可以保證轉(zhuǎn)谷氨酰胺的活性和穩(wěn)定性，又能提高一定的經(jīng)濟(jì)效益。由圖310所示，該酶在pH5～7左右最為穩(wěn)定，其相對(duì)酶活基本沒有太大的變化。圖39 pH對(duì)酶活的影響 圖310 酶的pH穩(wěn)定性 金屬離子對(duì)酶活影響由圖311各種金屬離子對(duì)酶活的影響可知，Ca2+、Mg2+、Ba2+對(duì)MTG的活性幾乎沒有影響，而Fe3+、Zn2+ 、Cu2+抑制酶活，其中Fe3+對(duì)其活性的影響最大。圖311 各種金屬離子對(duì)酶活的影響結(jié) 論轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀，超濾脫鹽，聚乙二醇濃縮， SepharoseG100凝膠過(guò)濾柱層析進(jìn)行分離純化，最后經(jīng)SDSPAGE檢驗(yàn)蛋白純度，所得到的結(jié)論如下：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀后，%。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶經(jīng)過(guò)Sephadex G100凝膠過(guò)濾柱層析后，%。對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，得到結(jié)論如下：轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適反應(yīng)溫度為40℃左右，溫度穩(wěn)定范圍為35℃～45℃，但綜合考慮其最佳的應(yīng)用溫度為37℃。由此可得出在實(shí)際的操作過(guò)程中，應(yīng)該選用對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最佳的反應(yīng)條件，避免混入可能抑制酶活性的離子，從而使其能最大的發(fā)揮其活性。還要感謝王強(qiáng)學(xué)長(zhǎng)在實(shí)驗(yàn)期間對(duì)我的幫助，使得我的畢業(yè)論文才能夠得以順利完成，謝謝王強(qiáng)學(xué)長(zhǎng)，以及所有幫助過(guò)我的老師和同學(xué)