【正文】 基、伯胺基或水，因而該酶可以催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸之間連接，以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺側(cè)鏈酰胺基的水解[1,2]，從而可以在很大程度上改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 O O O O O Oa酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng) b蛋白質(zhì)的Gln殘基和Lys殘基之間的交聯(lián)反應(yīng) c脫氨基化反應(yīng)圖11 ITGase催化的反應(yīng)　谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶能改變食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要由于：一是它可改變酪蛋白、肌球蛋白和β乳球蛋白等蛋白質(zhì)的物理特性；二是利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶催化作用可將各種必需氨基酸以共價(jià)鍵形式與各食品蛋白質(zhì)結(jié)合，以彌補(bǔ)加工過(guò)程中所流失或破壞之必需氨基酸而提高食品蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；三是不同蛋白質(zhì)也可通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用結(jié)合成一大分子，其物理特性與同種蛋白質(zhì)分子結(jié)合體類似，可作為開(kāi)發(fā)新蛋白食品的方法，如：各種人造肉、仿蟹肉等的開(kāi)發(fā)；四是在低蛋白質(zhì)濃度下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用所產(chǎn)生的聚合體可溶于水，但在高濃度下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用有助于膠體的形成。②多肽鏈中賴氨酸殘基的ε氨基，形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的ε(γ谷氨酰)賴氨酸異肽鍵，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，從而改善食物的質(zhì)構(gòu)，改善蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性、乳化性等許多物理性質(zhì)。肝臟谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶分子量為(75~80)103道爾頓，分為Ⅰ、Ⅱ型。19世紀(jì)80年代末，Ando[1]等人首先報(bào)道了微生物發(fā)酵生產(chǎn)MTG，并獲得了成功，而且利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有穩(wěn)定性強(qiáng)、不依賴Ca2+、催化交聯(lián)度高、pH適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。1993年Takagi等人首先成功地分離和純化了編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的DNA，并確定了它的堿基順序，在此基礎(chǔ)上，克隆出谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因，并通過(guò)該基因在宿主微生物如埃希氏菌屬大腸桿菌中的表達(dá)，有望提供一個(gè)有效的大量生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，但是在細(xì)胞中直接表達(dá)獲得酶產(chǎn)量并不理想，這可能是因?yàn)槠鋵?dǎo)致蛋白質(zhì)間的共價(jià)交聯(lián)嚴(yán)重影響了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性。2001年，同樣是常中義等人報(bào)道了酶蛋白水解物對(duì)輪枝鏈酶菌SK1產(chǎn)谷氨酰胺酶的影響，報(bào)道指出，當(dāng)酪蛋白水解物作為氮源時(shí)，其水解度對(duì)輪枝鏈酶菌產(chǎn)酶影響很大。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的生產(chǎn)狀況谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的生產(chǎn)方法主要有二種：動(dòng)植物組織提取法和微生物發(fā)酵生產(chǎn)法。另外從其它組織中如植物組織（豌豆種子、羽扇豆種子等）、魚(yú)組織經(jīng)過(guò)類似分離過(guò)程也可得到，但僅處于研究階段，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。另外，基因克隆方法也可用于生產(chǎn)谷氨酰胺胺酶。在肉制品加工過(guò)程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品如機(jī)械脫骨碎肉、膠原蛋白、血等均可用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶加工再利用。用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶處理可提高肉制品的顏色[13]。另外，在奶酪生產(chǎn)中，添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶處理后，使乳清蛋白與酪蛋白相互交聯(lián)在一起，可以提高奶酪產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用魚(yú)肉蛋白質(zhì)在低溫下能形成凝膠，是由于魚(yú)肉本身所含的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用結(jié)果。在生產(chǎn)蛋糕時(shí)，每克面粉加3單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，蛋糕的外觀、口感都得到了提高。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在人造產(chǎn)品加工中的應(yīng)用Tani利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶來(lái)修飾明膠，得到人造魚(yú)翅。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以其優(yōu)良特性在國(guó)外，尤其在日本得到廣泛應(yīng)用，它不僅可改善食品功能特性，也可以通過(guò)交聯(lián)作用，用以開(kāi)發(fā)新的具有更高營(yíng)養(yǎng)特性新食品資源。 本課題研究方案通過(guò)查閱資料，現(xiàn)確定將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶主要通過(guò)以下四個(gè)步驟對(duì)其進(jìn)行分離純化，分別為：硫酸銨分級(jí)沉淀，超濾脫鹽，聚乙二醇濃縮， Sephadex G100凝膠過(guò)濾柱層析。Folk等就是利用這個(gè)特性，設(shè)計(jì)了一種轉(zhuǎn)谷氨酸胺方法[16,17]，其具體催化反應(yīng)如下： TGase CHCH2OHN a CBZGInGly+H2NCHCH2OH Na CBZGInGly +NH3上式產(chǎn)生的Hydroxamic acid鹽可與三價(jià)鐵離子形成很穩(wěn)定的絡(luò)合物，呈紫紅色，而且色澤與該絡(luò)合物量呈正相關(guān)，于是通過(guò)定量該化合物可測(cè)量轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活力。試劑A：（pH=），；試劑B：3mol/LHCl，12%三氯乙酸及5％FeCl3相對(duì)酶活：以相同條件下所測(cè)定的最高酶活力定義為100，其余與之相比所得的數(shù)為相對(duì)酶活。 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取6支具塞試管，編號(hào)后，按21表加入試劑。表21 繪制考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表操作項(xiàng)目管 號(hào)1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液/mL0 0. 6 蒸餾水/mL 0G250試劑/mL各5蛋白質(zhì)含量/μg0 20 40 60 80 100注：G250考馬斯亮藍(lán)溶液：稱取100mg G250考馬斯亮藍(lán)，加入95%乙醇50mL，再加800mL水，加100mL 85%磷酸，定容至1000mL。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的硫酸銨分級(jí)沉淀取上述粗酶液，在粗酶液中加入固體硫酸銨至飽和度為35%（見(jiàn)表22），在冰箱中過(guò)夜，離心(8000r/min、10min)后，取上清液加入固體硫酸銨至飽和度為45%，冰箱中過(guò)夜，離心(8000r/min、10min)，在上清液加入固體硫酸銨至飽和度為55%，在冰箱過(guò)夜后，離心(8000r/min、10min)，直到將溶液的飽和度調(diào)到85%為止。()，將Tris溶于200mL水中，加入50mL的4mHCL溶液，定容到100mL容量瓶中。調(diào)節(jié)流速至1mL/min。(2)以恒流泵控制流速為1mL/min，用磷酸緩沖液洗脫平衡10min。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶純度的分析及分子量的測(cè)定　對(duì)所純化的蒜氨酸酶通過(guò)SDSPAGE進(jìn)行分析，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量推斷轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的分子量。濃縮膠貯備液配比為5%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液；分離膠貯備液配比為10%丙烯酰胺，%甲叉雙丙烯酰胺溶液。10%過(guò)硫酸銨：稱取過(guò)硫酸銨1g溶于10mL雙蒸水。樣品緩沖液：分別取雙蒸水4mL，?HCl，10%SDS ，%，總體積8mL，4℃保存。（2）配膠按照表23配制所需要的12%分離膠，4%濃縮膠。電泳槽裝好后，用注射器吸取融化的瓊脂注入背面下槽內(nèi)的小縫中。此時(shí)用裝有針頭的注射器將水層吸掉，然后沿玻璃板夾縫加入濃縮膠。（5）點(diǎn)樣向上、下槽內(nèi)注入電極緩沖液，上槽緩沖液必須蓋過(guò)短玻璃板。（8）脫色染色完畢后，倒出染色液，并換脫色液56次，直至凝膠的藍(lán)色背景褪盡，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止[18]。最后以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出酶反應(yīng)的最適溫度。以相同的方法將酶分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下保溫后進(jìn)行反應(yīng)，最后分別計(jì)算得出酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。以pH為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出酶反應(yīng)的最適pH值。以溫度為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出酶的pH穩(wěn)定性。以不同離子為橫坐標(biāo)，相對(duì)酶活為縱坐標(biāo)，作圖，得出不同離子對(duì)酶活力的影響。故可確定硫酸銨分級(jí)鹽析的飽和度為55%，75%。每個(gè)管中收集的溶液時(shí)間為1min，洗脫時(shí)間與管數(shù)成正比，即洗脫時(shí)間為多少時(shí)，代表所對(duì)應(yīng)的第多少管。從圖中可看出，在第51管和84管上蛋白質(zhì)含量出現(xiàn)一個(gè)峰值，但是相對(duì)應(yīng)的酶活性并不高，則可推斷該峰是由雜蛋白所產(chǎn)生的。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶SDSPAGE檢測(cè)用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗(yàn)純度后，結(jié)果如圖36所示。經(jīng)過(guò)超濾后，說(shuō)明通過(guò)超濾截留了一小部分雜蛋白。圖37 酶最適反應(yīng)溫度 圖38 酶的熱穩(wěn)定性綜合酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性來(lái)看，若想在實(shí)際生產(chǎn)中使轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶能最大限度的發(fā)揮其活性，并保持有一定的熱穩(wěn)定性，應(yīng)該將其溫度控制在37℃～45℃之間，再?gòu)膶?shí)際節(jié)約成本的角度分析，可將溫度控制在37℃左右，即可以保證轉(zhuǎn)谷氨酰胺的活性和穩(wěn)定性，又能提高一定的經(jīng)濟(jì)效益。圖39 pH對(duì)酶活的影響 圖310 酶的pH穩(wěn)定性 金屬離子對(duì)酶活影響由圖311各種金屬離子對(duì)酶活的影響可知，Ca2+、Mg2+、Ba2+對(duì)MTG的活性幾乎沒(méi)有影響，而Fe3+、Zn2+ 、Cu2+抑制酶活，其中Fe3+對(duì)其活性的影響最大。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶經(jīng)過(guò)Sephadex G100凝膠過(guò)濾柱層析后，%。由此可得出在實(shí)際的操作過(guò)程中，應(yīng)該選用對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最佳的反應(yīng)條件，避免混入可能抑制酶活性的離子，從而使其能最大的發(fā)揮其活性