【正文】 論 25參考文獻(xiàn) 26致　　謝 281 緒 論 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶概述 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶性能及分類轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TGase；；全稱為蛋白質(zhì)谷氨酰胺γ 谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶），又稱谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，谷氨酰胺酰－肽γ－谷氨酰胺酰基轉(zhuǎn)移酶，是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，它以肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ－羧酰胺基作為?；w，而?；荏w可以是多肽鏈中賴氨酸殘基的ε－氨基、伯胺基或水，因而該酶可以催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)和氨基酸之間連接，以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺側(cè)鏈酰胺基的水解[1,2]，從而可以在很大程度上改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。（2）是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中賴氨酸殘基的γ氨基作為酰基受體時(shí)，蛋白質(zhì)在分子內(nèi)或分子間形成ε (γ谷氨酰)賴氨酰共價(jià)鍵；可使各種蛋白分子形成交聯(lián)，從而對(duì)產(chǎn)品起到增加彈性和提高穩(wěn)定性的效果（3）是當(dāng)不存在伯胺時(shí)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶便以水為?；荏w而脫去氨基[3]。 O O O O O Oa?；D(zhuǎn)移反應(yīng) b蛋白質(zhì)的Gln殘基和Lys殘基之間的交聯(lián)反應(yīng) c脫氨基化反應(yīng)圖11 ITGase催化的反應(yīng)　谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶能改變食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)主要由于：一是它可改變酪蛋白、肌球蛋白和β乳球蛋白等蛋白質(zhì)的物理特性；二是利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶催化作用可將各種必需氨基酸以共價(jià)鍵形式與各食品蛋白質(zhì)結(jié)合，以彌補(bǔ)加工過程中所流失或破壞之必需氨基酸而提高食品蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；三是不同蛋白質(zhì)也可通過谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用結(jié)合成一大分子，其物理特性與同種蛋白質(zhì)分子結(jié)合體類似，可作為開發(fā)新蛋白食品的方法，如：各種人造肉、仿蟹肉等的開發(fā)；四是在低蛋白質(zhì)濃度下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用所產(chǎn)生的聚合體可溶于水，但在高濃度下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用有助于膠體的形成。谷氨酰胺是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶[7]，其作用特點(diǎn)如下：①RGluCONH2+NH2R’→RGluCONHR’+NH3②RGluCONH2+NH2LysR’→RGluCONHLysR’+NH3③RGluCONH2+H2O→RGluCOOH+NH3在其作用過程中，以γ羧酸酰胺基作為?；w，而?；荏w有以下幾種：①可催化在蛋白質(zhì)以及肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ羧酸酰胺基和伯胺之間的酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。②多肽鏈中賴氨酸殘基的ε氨基，形成蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的ε(γ谷氨酰)賴氨酸異肽鍵，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，從而改善食物的質(zhì)構(gòu)，改善蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性、乳化性等許多物理性質(zhì)。由于谷氨酰胺是不帶電荷的中性氨基酸，而谷氨酸是帶負(fù)電荷的酸性氨基酸，因此水解必然導(dǎo)致蛋白質(zhì)的性質(zhì)變化，從而改變蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和溶解度。肝臟谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶分子量為(75~80)103道爾頓，分為Ⅰ、Ⅱ型。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶分子量為40103道爾頓，活性中心也含有l(wèi)ys殘基，但活性中心不依賴Ca2+[8]。19世紀(jì)80年代末，Ando[1]等人首先報(bào)道了微生物發(fā)酵生產(chǎn)MTG，并獲得了成功，而且利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶具有穩(wěn)定性強(qiáng)、不依賴Ca2+、催化交聯(lián)度高、pH適應(yīng)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。從1989年日本味之素公司和天野制藥公司就開始研究利用微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)TGase。1993年Takagi等人首先成功地分離和純化了編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的DNA，并確定了它的堿基順序，在此基礎(chǔ)上，克隆出谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因，并通過該基因在宿主微生物如埃希氏菌屬大腸桿菌中的表達(dá)，有望提供一個(gè)有效的大量生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的方法，但是在細(xì)胞中直接表達(dá)獲得酶產(chǎn)量并不理想，這可能是因?yàn)槠鋵?dǎo)致蛋白質(zhì)間的共價(jià)交聯(lián)嚴(yán)重影響了谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的活性。近年來國(guó)內(nèi)也展開了對(duì)TGase的研究，但與國(guó)外研究水平有很大差距。2001年，同樣是常中義等人報(bào)道了酶蛋白水解物對(duì)輪枝鏈酶菌SK1產(chǎn)谷氨酰胺酶的影響，報(bào)道指出，當(dāng)酪蛋白水解物作為氮源時(shí)，其水解度對(duì)輪枝鏈酶菌產(chǎn)酶影響很大。我國(guó)現(xiàn)在的TGase制品生產(chǎn)也已進(jìn)入批量生產(chǎn)階段。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的生產(chǎn)狀況谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的生產(chǎn)方法主要有二種：動(dòng)植物組織提取法和微生物發(fā)酵生產(chǎn)法。其一般工藝流程為:豚鼠肝臟→均漿→離心→第二次離心→過濾→季銨乙基交聯(lián)葡聚糖離子交換→羥基磷灰石→親合力層析→谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶。另外從其它組織中如植物組織（豌豆種子、羽扇豆種子等）、魚組織經(jīng)過類似分離過程也可得到，但僅處于研究階段，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。1980年日本科技人員Ando等人報(bào)道了以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（Microbial Transglutaminase，簡(jiǎn)稱MTG），其基本工藝流程為：發(fā)酵液→離心→取上清液→超濾→取濃縮液→CG50離子交換樹脂→收集活性部分→再次通過CG5離子交換樹脂→收集活性部分→稀釋→通過藍(lán)瓊脂糖柱→谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(酶活性提高了174倍)[9]。另外，基因克隆方法也可用于生產(chǎn)谷氨酰胺胺酶。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的在食品上的應(yīng)用 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在肉制品加工中的應(yīng)用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可使肉中的許多蛋白質(zhì)交聯(lián)[9]，故在肉制品重組過程中谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶可以發(fā)揮重要作用。在肉制品加工過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品如機(jī)械脫骨碎肉、膠原蛋白、血等均可用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶加工再利用。交聯(lián)的蛋白質(zhì)可以作為脂肪的替代物，生產(chǎn)低脂肉制品。用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶處理可提高肉制品的顏色[13]。谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶形成的凝膠有良好的特性，如增強(qiáng)了對(duì)酸、對(duì)熱的抵抗性，提高了保水性。另外，在奶酪生產(chǎn)中，添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶處理后，使乳清蛋白與酪蛋白相互交聯(lián)在一起，可以提高奶酪產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。此外，許多研究表明，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶能提高乳的熱穩(wěn)定性。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用魚肉蛋白質(zhì)在低溫下能形成凝膠，是由于魚肉本身所含的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用結(jié)果。如果不加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，則壓制出來的蝦肉薄片或厚薄不一，或斷裂不成型。在生產(chǎn)蛋糕時(shí)，每克面粉加3單位谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，蛋糕的外觀、口感都得到了提高。在大豆制品加工中，Kato研制了一種耐保存的麻婆豆腐，將豆?jié){與葡萄糖酸內(nèi)酯、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶混合，于50℃下保溫lh，后經(jīng)110℃下殺菌處理制成產(chǎn)品。 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在人造產(chǎn)品加工中的應(yīng)用Tani利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶來修飾明膠，得到人造魚翅。 本課題的來源及研究的意義 本課題來源國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)課題。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶以其優(yōu)良特性在國(guó)外，尤其在日本得到廣泛應(yīng)用，它不僅可改善食品功能特性，也可以通過交聯(lián)作用，用以開發(fā)新的具有更高營(yíng)養(yǎng)特性新食品資源。目前，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶已廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、植物蛋白制品、焙烤制品，但目前國(guó)內(nèi)研究與國(guó)外相比尚有很大差距，且具體在我國(guó)食品工業(yè)中應(yīng)用更少。 本課題研究方案通過查閱資料，現(xiàn)確定將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶主要通過以下四個(gè)步驟對(duì)其進(jìn)行分離純化，分別為：硫酸銨分級(jí)沉淀，超濾脫鹽，聚乙二醇濃縮， Sephadex G100凝膠過濾柱層析。然后對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)做初步的研究，包括確定酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性、最適pH和pH穩(wěn)定性以及金屬離子對(duì)酶活影響，并綜合考慮得出在實(shí)際生產(chǎn)中所能發(fā)揮酶活性并保持其穩(wěn)定性的最佳條件。Folk等就是利用這個(gè)特性，設(shè)計(jì)了一種轉(zhuǎn)谷氨酸胺方法[16,17]，其具體催化反應(yīng)如下： TGase CHCH2OHN a CBZGInGly+H2NCHCH2OH Na CBZGInGly +NH3上式產(chǎn)生的Hydroxamic acid鹽可與三價(jià)鐵離子形成很穩(wěn)定的絡(luò)合物，呈紫紅色，而且色澤與該絡(luò)合物量呈正相關(guān)，于是通過定量該化合物可測(cè)量轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活力。 L谷氨酸γ單羥肟酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，溶于30mL蒸餾水中配制成10mmol/L的溶液，取八支具塞試管，一支作為空白對(duì)照，在空白管中加入1mL蒸餾水，，然后于八支試管中分別加入已經(jīng)預(yù)熱到37℃的2mLA試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min，立即取出加入已經(jīng)預(yù)熱到37℃的2mLB試劑終止反應(yīng)，于525nm下測(cè)定其吸光值，平行測(cè)定3次，取其平均值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑A：（pH=），；試劑B：3mol/LHCl，12%三氯乙酸及5％FeCl3將已經(jīng)分別預(yù)熱到37℃的試劑A與酶液在37℃反應(yīng)10min后，添加預(yù)熱到37℃的試劑B終止酶反應(yīng)，并形成紅色鐵化合物，在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心15min除去沉淀，上清液于525nm測(cè)定吸光度。相對(duì)酶活：以相同條件下所測(cè)定的最高酶活力定義為100，其余與之相比所得的數(shù)為相對(duì)酶活?？捡R斯亮藍(lán)G－250法是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法，簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白