【正文】 60 年代，70 年代已在全世界普遍開展。便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動化生產(chǎn)。固定化酶是用物理的或化學(xué)的方法使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合或把酶包埋在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中制成的。固定化酶技術(shù)是把從生物體內(nèi)提取出來的酶，用人工方法固定在特定的載體上。這大大地阻礙了酶工程的發(fā)展應(yīng)用。而且酶往往在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)以后會殘留在溶液系統(tǒng)中不易回收，造成最終產(chǎn)品生化分離提純操作上的麻煩。這是任何無機(jī)催化劑都無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。表38 金屬離子對酶活性影響試劑相對酶活100%1mmol/L10mmol/L100mmol/L空白對照Fe3+ndFe2+K+Na+Mn2+Mn2+Ca2+ndZn2+ndndCu2+ndndnd注：nd表示酶的相對活性低于5%，可忽略不計(jì)。Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+和Cu2+對β乳糖苷酶酶活有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用加強(qiáng)，其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng)。圖371 溫度對酶活的影響圖372 溫度對酶的穩(wěn)定性的影響同金屬離子及離子濃度對β半乳糖苷酶的影響結(jié)果如表38所示。圖361 pH對酶活性的影響圖362 pH對酶穩(wěn)定性的影響 溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響從圖371可以看出，酶的最適溫度在35℃左右，40℃時(shí)仍能保持90%以上活力，40℃之后酶活開始下降，60℃時(shí)只剩30%左右。由圖332可以看出。圖35 接種量對產(chǎn)酶能力的影響 pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響pH值對酶催化反應(yīng)的影響分別為影響酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物效率以及酶的穩(wěn)定性。接種量太小，菌的生物量不足，對產(chǎn)酶不利，接種量太大，營養(yǎng)不足，同樣會影響酶的表達(dá)量。所以，在以下試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間均設(shè)定為24 h時(shí)取樣。β半乳糖苷酶在菌株的對數(shù)生長前期表達(dá)量很低，進(jìn)入平緩期后β半乳糖苷酶開始大量表達(dá)。因此，以下試驗(yàn)均采用單菌落培養(yǎng)10 h的菌液作為種子菌液。對數(shù)生長期細(xì)菌代謝旺盛、酶活性高而且穩(wěn)定，菌體大小比較一致。根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，初步判斷其為枯草芽孢桿菌。表1 列出了篩選獲得的9株菌的β半乳糖苷酶水解活性的測定結(jié)果。東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文第3章 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 高產(chǎn)β半乳糖苷酶細(xì)菌的篩選用土壤為樣本，以乳糖為唯一碳源，篩選出乳糖利用菌株。 mol/L磷酸鈉緩沖液()混勻后，分別在30，40，50，和60℃保溫4 h，每隔1 h測一次殘留的酶活，分析溫度對β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。將β半乳糖苷酶在上述緩沖液中37℃保溫2 h和24h后，測殘留的酶活力，分析pH值對β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 pH值對β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響，確定pH值對β半乳糖苷酶活力的影響。 培養(yǎng)時(shí)間對菌株產(chǎn)酶能力的影響將種子菌液以2％的比例接種到裝有30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中．在37℃、225 r/min的條件下培養(yǎng)，分別于0、1123460 h取樣，每個(gè)處理重復(fù)3次，測定生物量和酶活性并繪制曲線。測定菌液的吸光度OD595 (即生物量)。每個(gè)處理重復(fù)3次。1個(gè)酶活性單位(u)定義為在37℃下每分鐘分解出1μmol ONP所需的酶量。取 7 支試管分別吸取 0， ， ， ， ， ， ， ， 5mmol/ml ONP，補(bǔ)上述緩沖液至 ，然后 40℃保溫15min，加入 2mL ，1mol/LNaCO3，以第一管為空白，于 420nm 測定吸光度，以 ONP 的量為橫坐標(biāo)，以 A420 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。裂解后的菌液在4℃下以12000r/min離心10min，收集上清液，即為粗酶液。 β半乳糖苷酶粗酶液制備將純化菌株按體積分?jǐn)?shù)為1％的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h。 分離純化培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的藍(lán)色菌落，通過平板劃線進(jìn)行分離純化，重復(fù)三次；對分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)形態(tài)觀察和鏡檢，確定純培養(yǎng)。 產(chǎn)β半乳糖苷酶菌的篩選 菌株篩選方法 取土樣，稀釋10倍，置于80℃水浴鍋中加熱30min，以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。31東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文第2章 材料和方法 材料 材料與試劑菌種來源：春光乳制品廠附近采集的土壤鄰硝基苯βD半乳吡喃糖苷（ONPG）分析純鄰硝基苯酚（ONP）分析純5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷（Xgal）分析純二甲基甲酰胺（DMF）分析純蛋白胨、乳糖、瓊脂、酵母粉、NaCl 均為分析純 儀器與設(shè)備752型紫外/可見分光光度計(jì) 北京光學(xué)儀器廠HQZF全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司LRH250II生化培養(yǎng)箱 廣州醫(yī)療設(shè)備廠PB10 pH計(jì) Sartorius0．20 u m無菌濾器 SartoriuszC10恒溫水浴槽 寧波天恒儀器廠 培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基：蛋白胨2%，瓊脂2%，Xgal 20mg/ml，%，乳糖2%，%，蒸餾水100ml，~,121℃高壓蒸汽滅菌15~30min。同時(shí)用于孕酮、皮質(zhì)醇半抗原標(biāo)記，初步建立了該酶的液相競爭測定程序。加入牛乳中則可防止由牛乳中乳糖不能吸收而引起的乳糖不耐癥。該法簡便快捷，費(fèi)用低廉，又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合于在食品工業(yè)上進(jìn)行應(yīng)用[12]。低聚半乳糖的熱穩(wěn)定性較好，即使在酸性條件下也是如此，并且具有許多生理功能，如作為雙歧桿菌增殖因子；能促進(jìn)鈣質(zhì)吸收和防止骨質(zhì)減少；有利于促進(jìn)有機(jī)酸生成，降低腸道pH值，抑制外源菌的生長代謝；有利于B族維生素產(chǎn)生；低能量；低致齲齒性；改善脂質(zhì)代謝等[11]。 在乳味面包中的應(yīng)用在乳味面包制作中，添加β半乳糖苷酶水解乳，能夠增加面包甜度，提高酵母菌產(chǎn)氣量，使面包更加膨脹，而且水解乳中的半乳糖有利于褐變，改善面包色澤。用β半乳糖苷酶將乳清中的乳糖水解，可以提高含乳清飼料的營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)去除了乳清濃縮時(shí)乳糖結(jié)晶析出給飼料加工帶來的不便。世界年產(chǎn)量約為9180。 在酸乳制作中的應(yīng)用用β半乳糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脫脂乳省時(shí)且節(jié)省蔗糖用量，而且能改善酸乳風(fēng)味和口感，延長酸乳的貨價(jià)期。 防止乳制品冷凍時(shí)出現(xiàn)結(jié)晶乳糖的溶解度較低，只有蔗糖的10％，在制作冷凍乳制品時(shí)容易結(jié)晶析出，影響產(chǎn)品質(zhì)量。采用給患者同時(shí)服用乳制品和β半乳糖苷酶片(通常是霉菌β半乳糖苷酶，它的最適pH值與胃環(huán)境相一致)，也可以解決這一問題。但據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，有10％的白人，51％的印第安人，81％的非裔加勒人和70％的亞洲人由于腸道內(nèi)缺乏β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不適癥(又稱乳糖不耐癥)[7]。目前應(yīng)用較多的霉菌β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉（Aspergillus oryzse）和黑曲霉（Aspergillus niger）。曲霉β半乳糖苷酶的最適pH值較低，適用于面包的制造以及分解面團(tuán)中的乳糖，有利于酵母發(fā)酵，并使制品具有良好的色澤。霉菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic）是生產(chǎn)β半乳糖苷酶的主要酵母菌種。但是，酵母菌容易培養(yǎng)，在深層培養(yǎng)條件下可以大量生產(chǎn)β半乳糖苷酶，這些優(yōu)點(diǎn)掩蓋了它的不足，故酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶才得以成功的進(jìn)行開發(fā)。但因產(chǎn)量低及可能的毒性問題，故迄今未用于工業(yè)化生產(chǎn)。 細(xì)菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶細(xì)菌β半乳糖苷酶，尤其是嗜熱細(xì)菌產(chǎn)生的酶正得到廣泛的研究，到目前為止，大腸桿菌（Escherichia coli）產(chǎn)生的β半乳糖苷酶是研究的最徹底、最深入，并已大量用于生化分析中。目前僅來源于微生物的β半乳糖苷酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，利用微生物發(fā)酵法制取β半乳糖苷酶，酶源豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。因此，β半乳糖苷酶具有廣闊的市場前景，并且會取得相當(dāng)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。隨著研究的不斷深入，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活性會進(jìn)一步得到提高。工業(yè)生產(chǎn)上最直接、有效的方法就是將酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，該法水解條件溫和（~8，溫度50~60℃），產(chǎn)物簡單，不會破壞乳中的其他營養(yǎng)成分。上海復(fù)旦大學(xué)的郭杰炎等以乳酸酵母Y121發(fā)酵生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活力達(dá)40u/ml（ONPG單位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活殘存98%。1990年無錫輕工業(yè)大學(xué)的李強(qiáng)軍等選育到黑曲霉菌CWL2NU3，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)酶活力達(dá)12u/ml（ONPG單位）。國內(nèi)對β半乳糖苷酶的研究起步較晚，是在20世紀(jì)80年代以后開始的。1972年Rorglun等報(bào)道了真菌β半乳糖苷酶的特性。1948年Caputto[2]等討論了通過大量培養(yǎng)和純化脆壁酵母（Saccharimyces fragilis）生產(chǎn)β半乳糖苷酶的方法。1889年，荷蘭生物學(xué)家Beijerincek第一次報(bào)道了β半乳糖苷酶可水解乳糖。 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢歷史上，β半乳糖苷酶的研究為微生物學(xué)的發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。此外，β半乳糖苷酶可被加工成液態(tài)、藥劑或粉末狀形式的產(chǎn)品，用來治療乳糖不耐癥。采用篩選出的菌種進(jìn)行酸奶加工，驗(yàn)證其加工性能，掌握其工藝加工性能和應(yīng)用于乳品加工的潛力，從而將其應(yīng)用于乳品發(fā)酵產(chǎn)品，降低乳糖含量，緩解人體普遍存在的乳糖不耐癥，擴(kuò)大乳品的消費(fèi)量。乳酸菌定植于腸道內(nèi)，它們?nèi)阅艽x被攝入人體內(nèi)的乳糖。 課題研究目的和意義β半乳糖苷酶可以有效降低乳制品中乳糖含量。因此解決乳糖不耐癥最好的辦法是將乳糖從食物中去除，以無乳糖配方的形式供給人體。乳糖消化的程度取決于以下幾種因素：乳糖攝入量、在腸胃內(nèi)停留時(shí)間（由飲食時(shí)間決定）、β半乳糖苷酶攝入量以及乳制品攝入量。此外，主要碳水化合物為乳糖的牛奶是一種全價(jià)