【正文】 s multiple range test. 不同培養(yǎng)時間對幾丁質(zhì)誘導 R. paludigenum 生防效力的影響 %（ w/v） 的 NYCB 培養(yǎng)基分別培養(yǎng) 2 3 4 72 和 96 h 后， R. paludige。字母代表不同顯 著性（ P ）。 106C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml）。 107C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1107cell/ml） 。 108C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 17 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 Fig. 24 Efficacy of R. paludigenum at various concentrations (106, 107 and 10 8 cells/ml) after cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin（ %） in inhibiting the disease incidence of Penicillium expansum in apple fruit wounds at 7th day. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。 誤差線代表標準誤差。 106N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml） 。 107N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1107cell/ml） 。 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 16 020406080100120ddbcaa107N 106C106N107C108N 108CDisease incidence(%)C ont rolaT reat m ent 圖 24 幾丁質(zhì)誘導后不同濃度 R. paludigenum 酵母對蘋果青霉病 第 7 天的 抑制效果 108N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 E: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin. Bars represent standard errors of three replications. 幾丁質(zhì)誘導后不同濃度 R. paludigenum 酵母 的生防效果 試驗結(jié)果表明，酵母的生防效果隨著其濃度的增加而顯著增強。 C: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin。 E: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum. Fig. 23 Incidence of blue mold decay caused by Penicillium expansum on apples inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. A: R. paludigenum cultured in NYDB。 C: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。 C ont rol A B C D E020406080100bcccbbDIsease incidence (%)T reat m enta C ont A B C D E048121620bbbbbLesion diameter (mm)T reat m enta 圖 23 不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)后 第 5 天 R. paludigenum 對蘋果青霉病的生防效果 A: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。s multiple range tests. 6d 7d012345cbcabaababababLesion diameter (mm)D ay s af t er i nocul at i on(d) N Y D B N Y C B ( 0. 1%) N Y C B ( 0. 2%) N Y C B ( 1. 0%) N Y C B ( 2. 0%) a 圖 22 不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)后 R. paludigenum 對梨青霉病病斑直徑的影響 Fig. 22 Severity of blue mold decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。同時，結(jié)合病斑直徑的情況，生防效果最好的處理為 %的 NYCB培養(yǎng)的 R. paludigenum。第 6 天時， NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum處理后梨青霉病發(fā)病率為 %，而添加了 %、 %、 %和 %幾丁質(zhì)后，其發(fā)病率分別僅為 %、 %、 %和 %。采用 軟件作圖。每處理 3 個平行，每平行包括 12 個果實。 2 小時后，在每個傷口處加入 30 μl的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 cells/ml。 幾丁質(zhì)與 NaCl 結(jié)合誘導對拮抗酵母生防活性的影響 酵母活化和液體培養(yǎng)、菌體收集同 ，幾丁質(zhì)濃度取 %（ w/v） ，NaCl濃度取 %（ w/v） ，二代液體培養(yǎng)時間為 36 h，所得酵母細胞懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)后配制成所需濃度備用。用 PE 塑料膜密封作保濕處理，并在室溫（ 20~25℃ ）下貯藏，每天定時記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（ %）和病斑直徑（ mm）表示。在試驗果實的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個傷口處分哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 13 別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng) 24 h的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度為 %（ w/v）的 NYCB 中分別培養(yǎng) 2 3 4 7 96 h 的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）。整個實驗重復 2 次以上。每天定時對果實傷口處病害發(fā)生和發(fā)展情況進行觀察和記錄，結(jié)果以平均病害發(fā)生率（ %）和平均病斑直徑（ mm）表示。l）的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 spores/ml。l）加入：（ 1） NYDB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 10 10 108 cells/ml）；（ 2） NYDB 培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 10 10 108cells/ml）；（ 3）無菌水（作為對照）。 幾丁 質(zhì)誘導后不同濃度 R. paludigenum 酵母的生防效果 用消過毒的打孔器在每個果實表面形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。用 PE 塑料膜密封作保濕處理，并在室溫（ 20～ 25℃ ）下貯藏，每天定時記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（ %） 和病斑直徑（ mm）表示。在試驗果實的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個傷口處分別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度分別為 %、 %、%和 %（ w/v） 的 NYCB中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）。選取外觀飽滿，無機械傷口、無病蟲害、無感染，大小和成熟度均勻一致的果實進行試驗，用 %次氯酸鈉溶液浸泡消毒 1~2 min、用自來水沖洗、并在室溫下放干（ 20℃ ~25℃ ）后備用。 試劑 幾丁質(zhì)（ Chitin）為生化純試劑，使用前先研磨，并用 100 目篩網(wǎng)過濾哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 12 后備用。 病原菌菌懸液的制備 從病原菌保存斜面中 挑取適量的霉菌孢子，在 PDA 斜面上劃線，置于培養(yǎng)箱中，在 28℃ 培養(yǎng) 7 d 后， 用接種環(huán)在培養(yǎng)好的霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到 適量 ％ 吐溫 20（ tween20） 溶液中，用血球計數(shù)板計數(shù)，并用 ％ 吐溫 20溶液調(diào)整至 5104 個 /ml，待用 (Zhang et al., 20xx。 酵母誘導培養(yǎng) 保存的酵母菌種首先在 NYDA 斜面培養(yǎng)基中進行活化，劃線接種后置于培養(yǎng)箱中 28℃ 培養(yǎng) 48 h，重復傳代兩次；活化好的酵母用接種環(huán)挑取一菌環(huán)接入 NYDB 種子培養(yǎng)基中，在 200 rpm、 28℃ 條件 下培養(yǎng) 24 h；將 2 ml上述種子培養(yǎng)基分別接入 NYDB 和加入一定量幾丁質(zhì)粉末的 NYDB 培養(yǎng)基中（記為 NYCB），在 200 rpm、 28 ℃ 條件下培養(yǎng)一定時間；發(fā)酵液在 4000 rpm條件下離心 5~10 min 收集酵母細胞，并用無菌水洗滌 2 次以充分除去培養(yǎng)基，上清液用 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。 實驗材料和方法 主要儀器 TH3560 全自動滅菌鍋 造鑫 (TSAO HSIN)企業(yè)有限公司 SWCJ1F 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 SIGMA 3K15 離心機 德國希格瑪（ SIGMA）公司 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 11 QYC211 全溫空氣搖床 上海?，攲嶒炘O備有限公司 Sartrious 電子天平 北京賽多利斯天平 有限公司 200 ?l、 1000 ?l、 5ml移液器 德國 Eppendorf 公司 血球計數(shù)板（ 2516） 上海醫(yī)用光學儀器廠 光學顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司 LRH250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司 拮抗菌及其培養(yǎng) 拮抗菌 Rhodosporidium paludigenum，分離自中國東海近海 海域，并經(jīng)英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心（ CABI Bioscience Identification Services）鑒定。 用 R. paludigenum 干粉制劑進行了食品級小鼠急性經(jīng)口毒性實驗，初步確定該制劑屬于實際無毒類。 本實驗中所用到的生防酵母為，從中國東海近海海域中分離篩選到的一株對果蔬采后病害具有較好抑制效果的海洋酵母，經(jīng) 英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心（ CABI Bioscience Identification Services ） 鑒定為Rhodosporidium paludigenum Fell amp。 幾丁質(zhì)（ Chitin），又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動物的外殼與內(nèi)骨骼，節(jié)肢動物的外 骨骼及真菌、酵母菌等微生物細胞壁中。 近年來，果蔬采后病害生物防治的研究重點是酵母菌。 為 通過幾丁質(zhì)及其衍生物等酵母細胞壁組分誘導拮抗酵母，提高其拮抗效力建立理論基礎。 本實驗的順利實施，可為系統(tǒng)全面地提高拮抗酵母的生防活性提供一個新的有效途徑，促進其進一步邁向商業(yè)化推廣應用。但是要 實現(xiàn)拮抗酵母的商業(yè)化推廣應用，迫切需要解決的問題是提高其生物學效力。研究幾丁質(zhì)誘導后 R. paludigenum 對蘋果、梨采后主要真菌病害擴展青霉（ P. expansum）體內(nèi)的抑制效果，篩選出最佳誘導劑量及誘導時間，并結(jié)合其他誘導因子為蘋果、梨采后病害提供一種安全、經(jīng)濟有效的防治方法， 并對可哈爾濱工業(yè)大學學士學