【正文】 的可以替代化學(xué)殺菌劑，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意義。近幾年來，低溫冷藏技術(shù)又有新的發(fā)展，采用臨界點(diǎn)低溫高濕存儲，即控制在物料冷害點(diǎn)溫度以上 ℃ ～ 1℃ 和相對濕度為 90％～ 98％的環(huán)境中存儲保鮮果蔬。目前，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，低溫貯藏鏈結(jié)合化學(xué)殺菌劑是比較成熟的商業(yè)采后處理技術(shù)。 目前已經(jīng)有 4 個(gè)基于拮抗微生物的生物防腐劑產(chǎn)品： Aspire（基于拮抗酵母 Candida oleophila，美國）， Yield Plus（基于拮抗酵母 Cryptococcus albidus， 南非）， BioSave 10LP（基于拮抗細(xì)菌 Pseudomonas syringae strain，美國）和 Avogreen（基于拮抗細(xì)菌 Bacillus subtilis，南非）（ Janisiewicz 和Korsten， 20xx； Fravel， 20xx）。生防通常是一個(gè)以上的機(jī)制共同作用的結(jié)果。在對 E. herbicola B66和 B90 抑制蘋果青霉病和灰霉病 的研究中發(fā)現(xiàn) ，在稀釋的蘋果汁中， B66 和B90 能抑制灰葡萄孢和擴(kuò)展青霉分生孢子的萌發(fā)并溶解其萌發(fā)管（ Sobiczewski et al, 1996） ，但 在未稀釋的蘋果汁里這些反應(yīng)并不明顯，說明營養(yǎng)競爭在這里起到了非常重要的作用。 已有的研究結(jié)果顯示，生防菌在果實(shí)傷口處接種越早，其對果蔬采后病原菌的抑制效果越好（ ChandGoyal and Spotts, 1997。 ChandGoyal and Spotts, 1996）。 重寄生作用 許多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（幾丁酶， β1,3葡聚糖酶等），從而分解病原菌的細(xì)胞壁或菌絲體。但需要進(jìn)一步研究這些酶的來源及其在生物防治中的作用。這些吸附現(xiàn)象不能完全說明在拮抗菌與病原菌之間有重寄生作用，但可以肯定這種現(xiàn)象與拮抗菌的生理活動緊密聯(lián)系，因?yàn)榻?jīng)過熱殺死的拮抗菌不再有吸附現(xiàn)象發(fā)生。已有的大量 研究表明 ， 多種 生防 菌，包括出芽短梗霉 （ A. pullulans） 、 C. saitoana、C. oleophila、膜醭畢赤酵母 （ P. membranefaciens） 和羅倫隱球酵母 （ C. laurentii）等均 能誘導(dǎo)多種果實(shí)的抗性及抗性相關(guān)反應(yīng) ，提高果實(shí)自身抗性，減少采后腐爛 （表 ） （ Filonow, 1999, 20xx。 Janisiewicz et al., 1991）。 抗生素名稱 產(chǎn)生菌株 針對 病原菌 蒿屬香豆素、東莨菪亭 無名假絲酵母 (C. famata) 指狀青霉 毒性蛋白 (killer protein) 畢赤酵母屬 (Pichia sp.) 抗細(xì)菌物質(zhì) 羅倫隱球酵母 （ C. laurentii） 熒光假單胞菌、 Staphylococcus aureus 揮發(fā)性物質(zhì) 乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis) 擴(kuò)展青霉 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 7 表 采后拮抗 菌 對果實(shí)抗性的誘導(dǎo)及對抗性相關(guān)反應(yīng)的刺激 果實(shí) 拮抗菌 備注 蘋果 出芽短梗霉 C. saitoana 刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和 POD 誘導(dǎo)抗性，并刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶 分泌 ?1,3葡聚糖酶 柚子 柑橘 C. oleophila 誘導(dǎo)抗性，并刺激果實(shí)乙烯、 PAL, 幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶、積累植保素等 刺激果實(shí)硫還原蛋白基因表達(dá) 刺激幾丁質(zhì)酶 cDNA 的表達(dá) 刺激 ?1,3內(nèi)葡聚糖酶基因表達(dá) 草莓 出芽短梗霉 誘導(dǎo)抗性 櫻桃 番茄 膜 醭畢赤酵母 刺激果實(shí) POD，降低 CAT 和 SOD，提高總蛋白，增強(qiáng) 33和 47kDa 蛋白 刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶 桃 、梨、棗、蘋果 羅倫隱球酵母 誘導(dǎo)果實(shí)抗性；刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、 ?1,3葡聚糖酶、 POD和 PAL 活性 刺激果實(shí) ?1， 3葡聚糖酶基 因表達(dá) 表 主要產(chǎn)抗生素菌株 抗生素名稱 產(chǎn)生菌株 作用對象 病原菌 伊枯草菌素 枯草芽孢桿菌 B3 核果類水果 M. fructicola 吡咯菌素 洋蔥假單胞菌 (P. cepacia) LT412W 梨果 、柑橘 核果類水果 擴(kuò)展青霉、灰葡萄 孢 丁香霉素 E 丁香假單胞桿菌 ESC10 和 ESC11（ BioSave） 檸檬 吡喃酮 木霉 草莓、蘋果 灰葡萄孢 拮抗菌生理調(diào)控及機(jī)理的研究 近年來，隨著拮抗菌和病原菌之間 的 細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn) 通過調(diào)節(jié)采后拮抗酵母的生理代謝機(jī)制可能是增強(qiáng)其拮抗能力的有效途徑之一（ Janisiewicz 和 Korsten, 20xx） 。 拮抗 物質(zhì)的 分泌 和 積累 阿 根 廷學(xué) 者發(fā) 現(xiàn)粘 紅酵 母（ Rhodotorula glutini) 產(chǎn) 生 的一 種 酸（ rhodotorulic acid）能抑制許多病 原真菌，而且發(fā)現(xiàn)整合使用 rhodotorulic acid 和該粘紅酵母能增強(qiáng)其對果實(shí)病害的控制（ Calvente et al., 20xx； Sansone et al., 20xx）。 本課題研究目的 近年來，采后生物保鮮劑的發(fā)展遇到了瓶頸。一是拮抗酵母單獨(dú)作用時(shí)，效果還無法與化學(xué)殺菌劑相比，二是采后貯藏是一個(gè)長期的過程，酵母制劑的生防效果和貨架壽命受到了采收、處理、包裝和銷售等多個(gè)環(huán)節(jié)諸多因素的影響（ Janisiewicz et al., 20xx； Spadaro et al., 20xx）。但是要 實(shí)現(xiàn)拮抗酵母的商業(yè)化推廣應(yīng)用，迫切需要解決的問題是提高其生物學(xué)效力。 為 通過幾丁質(zhì)及其衍生物等酵母細(xì)胞壁組分誘導(dǎo)拮抗酵母，提高其拮抗效力建立理論基礎(chǔ)。 幾丁質(zhì)（ Chitin），又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動物的外殼與內(nèi)骨骼，節(jié)肢動物的外 骨骼及真菌、酵母菌等微生物細(xì)胞壁中。 用 R. paludigenum 干粉制劑進(jìn)行了食品級小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，初步確定該制劑屬于實(shí)際無毒類。 酵母誘導(dǎo)培養(yǎng) 保存的酵母菌種首先在 NYDA 斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，劃線接種后置于培養(yǎng)箱中 28℃ 培養(yǎng) 48 h，重復(fù)傳代兩次；活化好的酵母用接種環(huán)挑取一菌環(huán)接入 NYDB 種子培養(yǎng)基中，在 200 rpm、 28℃ 條件 下培養(yǎng) 24 h；將 2 ml上述種子培養(yǎng)基分別接入 NYDB 和加入一定量幾丁質(zhì)粉末的 NYDB 培養(yǎng)基中（記為 NYCB），在 200 rpm、 28 ℃ 條件下培養(yǎng)一定時(shí)間；發(fā)酵液在 4000 rpm條件下離心 5~10 min 收集酵母細(xì)胞，并用無菌水洗滌 2 次以充分除去培養(yǎng)基，上清液用 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。 試劑 幾丁質(zhì)（ Chitin）為生化純試劑，使用前先研磨，并用 100 目篩網(wǎng)過濾哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 12 后備用。在試驗(yàn)果實(shí)的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個(gè)傷口處分別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度分別為 %、 %、%和 %（ w/v） 的 NYCB中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）。 幾丁 質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度 R. paludigenum 酵母的生防效果 用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。l）的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 spores/ml。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2 次以上。用 PE 塑料膜密封作保濕處理，并在室溫（ 20~25℃ ）下貯藏，每天定時(shí)記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（ %）和病斑直徑（ mm）表示。 2 小時(shí)后，在每個(gè)傷口處加入 30 μl的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 cells/ml。采用 軟件作圖。同時(shí)，結(jié)合病斑直徑的情況，生防效果最好的處理為 %的 NYCB培養(yǎng)的 R. paludigenum。 C ont rol A B C D E020406080100bcccbbDIsease incidence (%)T reat m enta C ont A B C D E048121620bbbbbLesion diameter (mm)T reat m enta 圖 23 不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)后 第 5 天 R. paludigenum 對蘋果青霉病的生防效果 A: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。 E: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum. Fig. 23 Incidence of blue mold decay caused by Penicillium expansum on apples inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. A: R. paludigenum cultured in NYDB。 E: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin. Bars represent standard errors of three replications. 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度 R. paludigenum 酵母 的生防效果 試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母的生防效果隨著其濃度的增加而顯著增強(qiáng)。 107N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1107cell/ml） 。 誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤差。 108C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 17 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 106C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml）。s multiple range test. 不同培養(yǎng)時(shí)間對幾丁質(zhì)誘導(dǎo) R. paludigenum 生防效力的影響 %（ w/v） 的 NYCB 培養(yǎng)基分別培養(yǎng) 2 3 4 72 和 96 h 后， R. paludige。字母代表不同顯 著性（ P ）。 107C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1107cell/ml） 。 Fig. 24 Efficacy of R. paludigenum at various concentrations (106, 107 and 10 8 cells/ml) after cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin（ %） in inhibiting the disease incidence of Penicillium expansum in apple fruit wounds at 7th day. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。 106N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml） 。 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 16 020406080100120ddbcaa107N 106C106N107C108N 108CDisease incidence(%)C ont rolaT reat m ent 圖 24 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度 R. paludigenum 酵母對蘋果青霉病 第 7 天的 抑制效果 108N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 C: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin。 C: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。s multiple range tests. 6d 7d012345cbcabaababababLesion diameter (mm)D ay s af t er i nocul at i on(d) N Y D B N Y C B ( 0. 1%) N Y C B ( 0