【正文】 3 次，每個重復 12 個果實。在試驗果實的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約 直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個傷口處分別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度為 %（ w/v）的 NYCB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 4）在添加 %（ w/v） NaCl的 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液 （ 1108 cells/ml） ；（ 5）在添加 %（ w/v） NaCl 的 NYCB（幾丁質(zhì)濃度為 %， w/v）中培養(yǎng)的R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml） 。特別是 添加 %幾丁質(zhì)后， R. paludigenum 的生防效力顯著增強，處理后梨青霉病的發(fā)病率在第 6 d 和第 7 d 時僅為 NYDB 中培養(yǎng)酵母的 %和 %。 D: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。 108C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。s multiple range test. 05101520253035107Ceecdbb107N 106C106N108N 108CLesion diameter (mm)T reat m entC ont rola 圖 25 幾丁質(zhì)誘導后不同濃度 R. paludigenum 酵母對蘋果青霉病 第 7 天的 抑制效果 108N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 Fig. 25 Efficacy of R. paludigenum at various concentrations (106, 107 and 10 8 cells/ml) after cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin（ %） in inhibiting the of Penicillium expansum in apple fruit wounds at 7th day. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。 106N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml） 。 106C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml）。 D: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin。s multiple range tests. 類似的，在蘋果果實上，不同濃度 幾丁質(zhì) 誘導培養(yǎng)的 R. paludigenum 對青霉病的抑制作用也顯著增強，處理后第 5 d 時（圖 23），濃度為 %和%的 NYCB 誘導培養(yǎng)的酵母其發(fā)病率僅為 %，而 NYDB 培養(yǎng)的酵母其哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 15 發(fā)病率為 %，但是其病斑直徑之間無顯著性差異。 數(shù)據(jù)處理 分析與作圖 采用 SPSS 軟件 (Statistical Product and Service Solutions)進行數(shù)據(jù) 統(tǒng)計，數(shù)據(jù)采用 ANOVA 進行鄧肯氏差異分析方法（取 p）。 2 小時后，在每個傷口處加入 30 μl 的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 cells/ml。 2 h后在每個傷口加入等量（ 30 181。 幾丁質(zhì)對 R. paludigenum 生防效果的影響 不同濃度幾丁質(zhì)對拮抗酵母生防活性的影響 酵母活化和液體培養(yǎng)、菌體收集同 ，幾丁質(zhì)濃度取 %、 %、%和 %（ w/v） ，二代液體培養(yǎng)時間為 24 h，所得酵母細胞懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)后配制成所需濃度備用。菌種在 4℃ 下保存于 NYDA（葡萄糖 10 g，牛肉浸膏 8 g，酵母粉 5 g，瓊脂20 g，定容至 1000 ml 蒸餾水中， 121℃ 下滅菌 20 min）斜面培養(yǎng)基中。酵母 菌與其他生防菌相比，具有以下優(yōu)點：（ 1）不產(chǎn)生抗菌素，長期使用不會使病原菌對抗菌素產(chǎn)生抗性而降低生物防治效果，還可以避免某些抗生素對人體潛在的不良影響；（ 2）酵母菌能在貧乏營養(yǎng)環(huán)境中快速增殖，干燥情況下可在果蔬表面定殖并存活相當長的時間，能耐受低溫等不良環(huán)境；（ 3）大多數(shù)酵母菌可與一些食品添加劑（鈣鹽、鈉鹽、 EDTA 等）結(jié)合使用，并且能夠耐受一些低劑量化學殺菌劑（涕必靈等），從而減少化學殺菌劑的使用量，提高生防效果。 應用前景和學術(shù)價值 利用拮抗酵母對水果采后病害進行生物防治是目前國內(nèi)外研究的熱點，其 對于保護生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義 。近年來國際上已有研究采后拮抗酵母的分子特征和利用基因工程改造采后生物防治酵母的研究報道，但總體上成功的報道還很有限。因此進入 20 世紀 90 年代以后，拮抗菌的研究重點逐步從拮抗細菌轉(zhuǎn)向了拮抗酵母。 表 主要產(chǎn)胞外物質(zhì)菌株 誘導抗性 近 5 年來，拮抗 菌 誘導采后果實抗性 成為了生物防治的研 究熱點 。拮抗菌的快速定植和水果本身酶的誘導作用可能導致了胞外溶解酶的 數(shù)量增加。 營養(yǎng)和空間的競爭還被認為對病原真菌的次級代謝有作用（ Bjornberg and Schnurer, 1993。 Filonow（ 1998） 用 14C 標記的果糖、葡萄糖、蔗糖檢驗在蘋果傷口處的拮抗菌羅倫隱球酵母（ C. laurentii）、擲抱酵母（ S. roseus）與病原菌灰葡萄孢孢子在營養(yǎng)利用上的差別，發(fā)現(xiàn)拮抗菌攝取和利用 14C 果糖的量越大，對分生孢子萌發(fā)的抑制作用越強，說明營養(yǎng)競爭是重要的生防機制。利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物進行生物防治的方法近 10 年來已經(jīng)取得了突破性的進展， 被認為是最有希望替代化學殺菌劑的方法之一（ Janisiewicz 和 Korsten,20xx） 。 低溫冷藏是一種常用的 保鮮技術(shù)。 隨著國家經(jīng)濟發(fā)展和消費水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境保護意識的增強，化學殺菌劑的使用范圍越來越受 到 限制。nchezTorres and Gonz225。nchezTorres 和 Gonz225。 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 2 采后病原真菌的侵染方式 采后病原真菌主要通過 3 種途徑或方式入侵果實： (1)通過機械傷或蟲害等造成的傷口； (2)通過自然開放的皮孔、氣孔、果實和花梗結(jié)合部位； (3)通過分泌寄主細胞壁水解酶等直接突破果實表皮的防御機制（ Prusky 和Lichter, 20xx）。據(jù)此估算，我國每年水果采后的經(jīng)濟損失將達到數(shù)百億元人民幣的水平。 BCPD哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 目錄 1 目 錄 摘 要 ...................................................... Ⅰ ABSTRACT ................................................ Ⅱ 第一章 文獻綜述 .............................................. 1 我國水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述 ........................................... 1 果蔬采后病害的侵 染研究 ......................................... 1 采后病原真菌的侵染方式 ................................... 1 采后病原真菌的致病機理 ................................... 2 果蔬采后病害的控制方法 ......................................... 2 化學殺菌劑的使用 ......................................... 3 果實采后病害防治物理方法 ................................. 3 果實采后 病害 生物防治 ..................................... 4 采后拮抗酵母作用機制 ........................................... 4 營養(yǎng)和空間的競爭 ......................................... 4 重寄生作用 ............................................... 5 胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生 ....................................... 5 誘導抗性 ................................................. 6 抗生作用 ................................................. 6 拮抗菌生理調(diào)控及機理的研究 ..................................... 7 逆境培養(yǎng) ................................................. 7 拮抗 物質(zhì)的 分泌 和 積累 ..................................... 8 基因工程技術(shù) 的應用 ....................................... 8 本課題研究目的 ................................................. 8 應用前景和學術(shù)價值 ............................................. 9 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 ..... 10 前言 .......................................................... 10 實驗材料和方法 ................................................ 10 主要儀器 ................................................ 10 拮抗菌及其培養(yǎng) .......................................... 11 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備 ............................ 11 試劑 .................................................... 11 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 目錄 2 果實選擇與預處理 ........................................ 12 幾丁質(zhì)對 R. paludigenum 生防效果的影響 .................... 12 數(shù)據(jù)處理分析與作圖 ...................................... 13 結(jié)果 .......................................................... 13 不同濃度幾丁質(zhì)對 R. paludigenum 生防效力的影響 ............ 13 幾丁質(zhì)誘導后不同濃度 R. paludigenum 酵母的生防效果 ........ 15 不同培養(yǎng)時間對幾丁質(zhì)誘導下 R. paludigenum 生防效力的影響 .. 17 幾丁質(zhì)與 NaCl結(jié)合誘導對 R. paludigenum 生防效力的影響 ..... 18 討論 .......................................................... 20 第三章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制機理研究 ..... 22 前言 .......................................................... 22 實驗材料和方法 .............