【正文】 ................. 8 基因工程技術(shù) 的應(yīng)用 ....................................... 8 本課題研究目的 ................................................. 8 應(yīng)用前景和學(xué)術(shù)價(jià)值 ............................................. 9 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 ..... 10 前言 .......................................................... 10 實(shí)驗(yàn)材料和方法 ................................................ 10 主要儀器 ................................................ 10 拮抗菌及其培養(yǎng) .......................................... 11 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備 ............................ 11 試劑 .................................................... 11 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 目錄 2 果實(shí)選擇與預(yù)處理 ........................................ 12 幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 生防效果的影響 .................... 12 數(shù)據(jù)處理分析與作圖 ...................................... 13 結(jié)果 .......................................................... 13 不同濃度幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 生防效力的影響 ............ 13 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度 R. paludigenum 酵母的生防效果 ........ 15 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)下 R. paludigenum 生防效力的影響 .. 17 幾丁質(zhì)與 NaCl結(jié)合誘導(dǎo)對(duì) R. paludigenum 生防效力的影響 ..... 18 討論 .......................................................... 20 第三章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制機(jī)理研究 ..... 22 前言 .......................................................... 22 實(shí)驗(yàn)材料和方法 ................................................ 22 主要儀器 ................................................ 22 拮抗菌及其培養(yǎng) .......................................... 23 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備 ............................ 23 果實(shí)選擇與預(yù)處理 ........................................ 23 幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 生防機(jī)理的影響 .................... 23 數(shù)據(jù)處理分析與作圖 ...................................... 24 結(jié)果 .......................................................... 24 幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 在果實(shí)傷口處生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響 ........ 24 幾丁質(zhì)處理后 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)誘導(dǎo)抗性的影響 .......... 26 幾丁質(zhì)處理后 R. paludigenum 發(fā)酵上清液的抑菌效果 .......... 27 幾丁質(zhì)培養(yǎng)后 R. paludigenum 對(duì)果實(shí) POD 酶活性的影響 ....... 27 討論 .......................................................... 28 第四章 結(jié)果 與 展望 ........................................... 30 本論文的主要研究結(jié)果 .......................................... 30 本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究及展望 ........................................ 30 致謝 ...................................................... 32 參考文獻(xiàn) ................................................... 33 附 錄 ...................................................... 37 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 我國(guó)水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述 水果是維生素、礦物質(zhì)和膳 食纖維的重要來(lái)源，是人們維持身體健康，增進(jìn)營(yíng)養(yǎng)必不可少的主要食品 ， 是世界上僅次于糧食的 農(nóng)產(chǎn)品 。中國(guó)是世界水果生產(chǎn)大國(guó)，總收獲面積和產(chǎn)量以及多種水果的產(chǎn)量均居世界首位。蔬菜、水果產(chǎn)業(yè)是我國(guó)國(guó)內(nèi)僅次于糧食產(chǎn)業(yè)的第二、第三大產(chǎn)業(yè)。 20xx 年 3 月國(guó)家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的《中華人民共和國(guó) 20xx 年國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》顯示， 20xx 年我國(guó)水果總產(chǎn)量為 17050 萬(wàn)噸。據(jù) 20xx 年初步統(tǒng)計(jì)， 20xx 全國(guó)水果面積約 億畝，與上年基本持平，產(chǎn)量 億噸，同比增 9％ 。 根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食組織對(duì) 50 多個(gè)國(guó)家的調(diào)查，發(fā)展中國(guó)家水果收獲后的平均損失率在 30%以上。我國(guó)水果因采后處理技術(shù)落后，作為產(chǎn)量第一大國(guó)，水果腐爛 損失也高居全球榜首。根據(jù)一般保守的估計(jì)，我國(guó)水果采后損失為20%～ 30％左右。據(jù)此估算，我國(guó)每年水果采后的經(jīng)濟(jì)損失將達(dá)到數(shù)百億元人民幣的水平。 導(dǎo)致果實(shí)采后損失的因素很多，主要包括： (1)由于采前栽培管理、采收和采后處理技術(shù)不當(dāng)而造成的損失； (2)由于果實(shí)采后水分和營(yíng)養(yǎng)消耗造成的失重和枯萎等品質(zhì)劣變而引起的損失； (3)由于采后逆境造成的果實(shí)生理代謝失調(diào)而引起的損失； (4)由于采后成熟衰老造成果實(shí)組織結(jié)構(gòu)崩潰而引起的損失； （ 5） 由于病原物侵染造成的腐爛損失等。 由各種病原物引起的植物病害每年都給各國(guó)經(jīng)濟(jì)造 成重大的損失，其中又以真菌性病害最為嚴(yán)重。據(jù)估計(jì)，僅美國(guó)每年由真菌性病害造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá) 330 億美元（ Maor 和 Shirasu, 20xx； Strange 和 Scott, 20xx）。真菌也是引起采后果實(shí)病害的主要病原物（ Sholberg 和 Conway， 20xx）。病原真菌不僅會(huì)造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可能會(huì)引起嚴(yán)重的食品安全問題，如曲霉菌（主要是 Aspergillums flavus和 Aspergillums parasiticus等）產(chǎn)生的黃曲霉毒素、擴(kuò)展青 霉（ Penicillium expansum）產(chǎn)生的棒曲霉素（ patulin）等（ Martins et al., 20xx； Sholberg 和Conway, 20xx； DombrinkKurtzman 和 Blackburn, 20xx； Brodhagen 和 Keller，20xx； Morales et al., 20xx）。 果蔬采后病害的侵染研究 由真菌病害引起的果實(shí)采后的腐爛變質(zhì)是導(dǎo)致水果大量損失的主要原因之一。病原真菌不僅會(huì)造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可 能引起嚴(yán)重的食品安全問題。 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 采后病原真菌的侵染方式 采后病原真菌主要通過(guò) 3 種途徑或方式入侵果實(shí)： (1)通過(guò)機(jī)械傷或蟲害等造成的傷口； (2)通過(guò)自然開放的皮孔、氣孔、果實(shí)和花梗結(jié)合部位； (3)通過(guò)分泌寄主細(xì)胞壁水解酶等直接突破果實(shí)表皮的防御機(jī)制（ Prusky 和Lichter, 20xx）。病原菌孢子一旦接觸傷口組織，侵染就開始了（ Janisiewicz和 Korsten, 20xx； Prusky 和 Lichter, 20xx）。而在沒有傷口等便利的入侵途徑的情況下，許多采后病原真菌的孢子可能會(huì)長(zhǎng)時(shí)間 潛伏在果實(shí)表面，直到果實(shí)成熟和衰老后才發(fā)起對(duì)果實(shí)的攻擊（ Prusky 和 Lichter, 20xx）。 采后病原真菌的致病機(jī)理 采后病原真菌具有眾多而且復(fù)雜的致病機(jī)理，但其最終目的都是成功的侵染寄主。病原真菌分泌產(chǎn)生的寄主細(xì)胞壁分解酶是研究較多、機(jī)理較為明確的重要致病因子，其主要包括多聚半乳糖醛酸酶（ polygalacturonase）、果膠裂解酶（ pectatelyase）、木聚糖酶（ xylanases）、木糖苷酶（ xylosidase）、蛋白酶（ protease）、葡聚糖酶（ glucanases）、漆酶（ laccase）等 (S225。nchezTorres和 Gonz225。lezCandelas， 20xx； Akimitsu et al., 20xx)。 這些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染機(jī)制和過(guò)程，如滲透、組織泡軟、營(yíng)養(yǎng)獲得、改變寄主生理等 （ S225。nchezTorres 和 Gonz225。lezCandelas, 1996； Akimitsu et al., 20xx）。 致病菌酸化果實(shí)組織 P. expansum、 P. digitatm 和 P. italicum 等酸性病原真菌能產(chǎn)生檸檬酸和葡萄糖 酸等有機(jī)酸，使寄主果實(shí)組織發(fā)生酸化，進(jìn)而促進(jìn)病原菌致病因子，如 PG 基因（ pepgl）的表達(dá)（ Prusky et al., 20xx）。 致病因子 CAT 活性氧（ Reactive Oxygen Species， ROS）在植物和微生物相互作用過(guò)程中具有重要作用（ Torres et al., 20xx)。最近，中科院植物所 Qin 等 （ 20xx）利用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，硼酸鹽抑制擴(kuò)展青霉的機(jī)理與硼酸鹽抑制該真菌體內(nèi)參與清除 ROS 的過(guò)氧化氫酶（ Catalase， CAT）及谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ Glutathione Stransferase）等有關(guān)，暗示擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的 CAT 等可能也是該病原菌的一個(gè)致病因子。 病原菌破壞植物自身防御機(jī)制 植物在遭到病原菌侵染時(shí)，通過(guò)體內(nèi)木質(zhì)素和羥脯氨酸糖的沉積，植物抗菌素的積累，蛋白質(zhì)酶抑制劑和溶菌酶的合成來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞壁的保衛(wèi)反應(yīng)。另一方面，病原真菌在侵染過(guò)程中能誘導(dǎo)激發(fā)果實(shí)組織的形態(tài)和生理、分子水平發(fā)生顯著變化（ Kim et al., 20xx。 S225。nchezTorres and Gonz225。lezCandelas, 20xx）。目前的一些研究顯示，病原菌能夠 刺激果實(shí) SOD、 PAL、 POD 等與抗病性密切相關(guān)的酶活性，分解果實(shí)自身抗菌物質(zhì)，誘導(dǎo)果實(shí)幾丁質(zhì)酶和?1,3葡聚糖酶活性，以及刺激相關(guān)基因的表達(dá)（ Yakoby et al., 20xx） 。 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 果蔬采后病害的控制方法 果蔬貯藏保鮮是果蔬生產(chǎn)減損、保值和增值的關(guān)鍵因素。特別是當(dāng)果蔬受到機(jī)械損傷后，病原菌更容易進(jìn)入傷口，導(dǎo)致病害的發(fā)生，所以有必要利用一些防治手段保護(hù)這些損傷位點(diǎn)，防止果蔬在儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中進(jìn)一步的腐爛變質(zhì)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道，控制采后病害非殺菌劑的方法主要可分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法 3 大類。 化學(xué)殺菌劑的使用 目前，化學(xué)殺菌劑是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一?；瘜W(xué)殺菌劑在全世界范圍廣泛使用，在歐洲和亞洲占農(nóng)藥市場(chǎng)的 26%，但在美國(guó)只占6%。 隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)食品安全和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，化學(xué)殺菌劑的使用范圍越來(lái)越受 到 限制。 有許多研究報(bào)道，化學(xué)殺菌劑具有一定的毒副作用。 美國(guó)國(guó)家科學(xué)院（ NAS）的報(bào)道（ 1987）指出，殺菌劑的應(yīng)用造成了人類健康的危害性，全美 9 種致瘤化合物的銷售量占所有殺菌劑的 90%左右，在用于食品的全部農(nóng)藥中，殺菌劑構(gòu)成 60%的致 癌危險(xiǎn)。這一報(bào)道導(dǎo)致了幾種殺菌劑如克菌丹（ Captan）