【正文】 備 ............................ 11 試劑 .................................................... 11 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 目錄 2 果實(shí)選擇與預(yù)處理 ........................................ 12 幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 生防效果的影響 .................... 12 數(shù)據(jù)處理分析與作圖 ...................................... 13 結(jié)果 .......................................................... 13 不同濃度幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 生防效力的影響 ............ 13 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度 R. paludigenum 酵母的生防效果 ........ 15 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)誘導(dǎo)下 R. paludigenum 生防效力的影響 .. 17 幾丁質(zhì)與 NaCl結(jié)合誘導(dǎo)對(duì) R. paludigenum 生防效力的影響 ..... 18 討論 .......................................................... 20 第三章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制機(jī)理研究 ..... 22 前言 .......................................................... 22 實(shí)驗(yàn)材料和方法 ................................................ 22 主要儀器 ................................................ 22 拮抗菌及其培養(yǎng) .......................................... 23 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備 ............................ 23 果實(shí)選擇與預(yù)處理 ........................................ 23 幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 生防機(jī)理的影響 .................... 23 數(shù)據(jù)處理分析與作圖 ...................................... 24 結(jié)果 .......................................................... 24 幾丁質(zhì)對(duì) R. paludigenum 在果實(shí)傷口處生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的影響 ........ 24 幾丁質(zhì)處理后 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)誘導(dǎo)抗性的影響 .......... 26 幾丁質(zhì)處理后 R. paludigenum 發(fā)酵上清液的抑菌效果 .......... 27 幾丁質(zhì)培養(yǎng)后 R. paludigenum 對(duì)果實(shí) POD 酶活性的影響 ....... 27 討論 .......................................................... 28 第四章 結(jié)果 與 展望 ........................................... 30 本論文的主要研究結(jié)果 .......................................... 30 本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究及展望 ........................................ 30 致謝 ...................................................... 32 參考文獻(xiàn) ................................................... 33 附 錄 ...................................................... 37 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 我國水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述 水果是維生素、礦物質(zhì)和膳 食纖維的重要來源，是人們維持身體健康，增進(jìn)營(yíng)養(yǎng)必不可少的主要食品 ， 是世界上僅次于糧食的 農(nóng)產(chǎn)品 。 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 采后病原真菌的侵染方式 采后病原真菌主要通過 3 種途徑或方式入侵果實(shí)： (1)通過機(jī)械傷或蟲害等造成的傷口； (2)通過自然開放的皮孔、氣孔、果實(shí)和花梗結(jié)合部位； (3)通過分泌寄主細(xì)胞壁水解酶等直接突破果實(shí)表皮的防御機(jī)制（ Prusky 和Lichter, 20xx）。nchezTorres and Gonz225。 低溫冷藏是一種常用的 保鮮技術(shù)。 Filonow（ 1998） 用 14C 標(biāo)記的果糖、葡萄糖、蔗糖檢驗(yàn)在蘋果傷口處的拮抗菌羅倫隱球酵母（ C. laurentii）、擲抱酵母（ S. roseus）與病原菌灰葡萄孢孢子在營(yíng)養(yǎng)利用上的差別，發(fā)現(xiàn)拮抗菌攝取和利用 14C 果糖的量越大，對(duì)分生孢子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)，說明營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)是重要的生防機(jī)制。拮抗菌的快速定植和水果本身酶的誘導(dǎo)作用可能導(dǎo)致了胞外溶解酶的 數(shù)量增加。因此進(jìn)入 20 世紀(jì) 90 年代以后，拮抗菌的研究重點(diǎn)逐步從拮抗細(xì)菌轉(zhuǎn)向了拮抗酵母。 應(yīng)用前景和學(xué)術(shù)價(jià)值 利用拮抗酵母對(duì)水果采后病害進(jìn)行生物防治是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其 對(duì)于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義 。菌種在 4℃ 下保存于 NYDA（葡萄糖 10 g，牛肉浸膏 8 g，酵母粉 5 g，瓊脂20 g，定容至 1000 ml 蒸餾水中， 121℃ 下滅菌 20 min）斜面培養(yǎng)基中。 2 h后在每個(gè)傷口加入等量（ 30 181。 數(shù)據(jù)處理 分析與作圖 采用 SPSS 軟件 (Statistical Product and Service Solutions)進(jìn)行數(shù)據(jù) 統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用 ANOVA 進(jìn)行鄧肯氏差異分析方法（取 p）。 D: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin。 106N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml） 。s multiple range test. 05101520253035107Ceecdbb107N 106C106N108N 108CLesion diameter (mm)T reat m entC ont rola 圖 25 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度 R. paludigenum 酵母對(duì)蘋果青霉病 第 7 天的 抑制效果 108N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 D: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。在試驗(yàn)果實(shí)的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約 直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個(gè)傷口處分別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對(duì)照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度為 %（ w/v）的 NYCB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 4）在添加 %（ w/v） NaCl的 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液 （ 1108 cells/ml） ；（ 5）在添加 %（ w/v） NaCl 的 NYCB（幾丁質(zhì)濃度為 %， w/v）中培養(yǎng)的R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml） 。每處理 3 個(gè)平行，每平行包括 12 個(gè)果實(shí)。 Tallman （ 1984）。拮抗酵母生防制劑商品化發(fā)展緩慢主要有兩個(gè)原因。 抗生作用 通過拮抗菌產(chǎn) 生抗生素抑制病原菌作用是人們最早發(fā)現(xiàn)的一種拮抗機(jī)理，也是大多數(shù)拮抗細(xì)菌最主要的機(jī)制之一（表 ）（ Janisiewicz and Roitman, 1988。比如Petersson和 Schnurer（ 1995） 發(fā)現(xiàn) P. anomala能在體外試驗(yàn)中減少 P. roquefortii和 亮白曲霉 (Aspergillums candidus)的數(shù)量。 采后拮抗酵母作用機(jī) 制 根據(jù)已有的研究結(jié)果顯示，微生物對(duì)病原菌有直接作用和間接作用兩種方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，間接作用包括營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)，胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生和誘導(dǎo)抗性等。 此外由于長(zhǎng)期使用殺菌劑，病原菌進(jìn)化 并 產(chǎn)生了大量抗藥性菌種。最近，中科院植物所 Qin 等 （ 20xx）利用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，硼酸鹽抑制擴(kuò)展青霉的機(jī)理與硼酸鹽抑制該真菌體內(nèi)參與清除 ROS 的過氧化氫酶（ Catalase， CAT）及谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ Glutathione Stransferase）等有關(guān)，暗示擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的 CAT 等可能也是該病原菌的一個(gè)致病因子。真菌也是引起采后果實(shí)病害的主要病原物（ Sholberg 和 Conway， 20xx）。 Tallman isolated by our laboratory Colleague in marine yeast (Identified by CABI Bioscience Identification Services as Rhodosporidium paludigenum Fell amp。本人授權(quán) 大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。其機(jī)理可能與激發(fā)蘋果果實(shí)傷口處組織的 POD 酶 活性有關(guān)。 導(dǎo)致果實(shí)采后損失的因素很多，主要包括： (1)由于采前栽培管理、采收和采后處理技術(shù)不當(dāng)而造成的損失； (2)由于果實(shí)采后水分和營(yíng)養(yǎng)消耗造成的失重和枯萎等品質(zhì)劣變而引起的損失； (3)由于采后逆境造成的果實(shí)生理代謝失調(diào)而引起的損失； (4)由于采后成熟衰老造成果實(shí)組織結(jié)構(gòu)崩潰而引起的損失； （ 5） 由于病原物侵染造成的腐爛損失等。lezCandelas, 1996； Akimitsu et al., 20xx）。 有許多研究報(bào)道，化學(xué)殺菌劑具有一定的毒副作用。 目前已經(jīng)有 4 個(gè)基于拮抗微生物的生物防腐劑產(chǎn)品： Aspire（基于拮抗酵母 Candida oleophila，美國）， Yield Plus（基于拮抗酵母 Cryptococcus albidus， 南非）， BioSave 10LP（基于拮抗細(xì)菌 Pseudomonas syringae strain，美國）和 Avogreen（基于拮抗細(xì)菌 Bacillus subtilis，南非）（ Janisiewicz 和Korsten， 20xx； Fravel， 20xx）。 ChandGoyal and Spotts, 1996）。已有的大量 研究表明 ， 多種 生防 菌，包括出芽短梗霉 （ A. pullulans） 、 C. saitoana、C. oleophila、膜醭畢赤酵母 （ P. membranefaciens） 和羅倫隱球酵母 （ C. laurentii）等均 能誘導(dǎo)多種果實(shí)的抗性及抗性相關(guān)反應(yīng) ，提高果實(shí)自身抗性，減少采后腐爛 （表 ） （ Filonow, 1999, 20xx。 本課題研究目的 近年來，采后生物保鮮劑的發(fā)展遇到了瓶頸。 幾丁質(zhì)（ Chitin），又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動(dòng)物的外殼與內(nèi)骨骼，節(jié)肢動(dòng)物的外 骨骼及真菌、酵母菌等微生物細(xì)胞壁中。在試驗(yàn)果實(shí)的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個(gè)傷口處分別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對(duì)照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度分別為 %、 %、%和 %（ w/v） 的 NYCB中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）。用 PE 塑料膜密封作保濕處理，并在室溫（ 20~25℃ ）下貯藏，每天定時(shí)記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（ %）和病斑直徑（ mm）表示。 C ont rol A B C D E020406080100bcccbbDIsease incidence (%)T reat m