【正文】 Fig. 25 Efficacy of R. paludigenum at various concentrations (106, 107 and 10 8 cells/ml) after cultivation in NYDB or NYDB amended with chitin（ %） in inhibiting the of Penicillium expansum in apple fruit wounds at 7th day. Bars represent standard errors. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。 106N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml） 。s multiple range test. 05101520253035107Ceecdbb107N 106C106N108N 108CLesion diameter (mm)T reat m entC ont rola 圖 25 幾丁質(zhì)誘導后不同濃度 R. paludigenum 酵母對蘋果青霉病 第 7 天的 抑制效果 108N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 106C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1106cell/ml）。 108C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的R. paludigenum（ 1108cell/ml） 。 D: R. paludigenum cultured in NYCB with % chitin。 D: %（ w/v）幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum。s multiple range tests. 類似的，在蘋果果實上，不同濃度 幾丁質(zhì) 誘導培養(yǎng)的 R. paludigenum 對青霉病的抑制作用也顯著增強，處理后第 5 d 時（圖 23），濃度為 %和%的 NYCB 誘導培養(yǎng)的酵母其發(fā)病率僅為 %，而 NYDB 培養(yǎng)的酵母其哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對果實采后真菌病害抑制效果研究 15 發(fā)病率為 %，但是其病斑直徑之間無顯著性差異。特別是 添加 %幾丁質(zhì)后， R. paludigenum 的生防效力顯著增強，處理后梨青霉病的發(fā)病率在第 6 d 和第 7 d 時僅為 NYDB 中培養(yǎng)酵母的 %和 %。 數(shù)據(jù)處理 分析與作圖 采用 SPSS 軟件 (Statistical Product and Service Solutions)進行數(shù)據(jù) 統(tǒng)計，數(shù)據(jù)采用 ANOVA 進行鄧肯氏差異分析方法（取 p）。在試驗果實的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約 直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個傷口處分別加入 50 μl下述液體（ 1）無菌水（作為對照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度為 %（ w/v）的 NYCB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 4）在添加 %（ w/v） NaCl的 NYDB 中培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液 （ 1108 cells/ml） ；（ 5）在添加 %（ w/v） NaCl 的 NYCB（幾丁質(zhì)濃度為 %， w/v）中培養(yǎng)的R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml） 。 2 小時后，在每個傷口處加入 30 μl 的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為 1104 cells/ml。每處理重復 3 次，每個重復 12 個果實。 2 h后在每個傷口加入等量（ 30 181。每處理 3 個平行，每平行包括 12 個果實。 幾丁質(zhì)對 R. paludigenum 生防效果的影響 不同濃度幾丁質(zhì)對拮抗酵母生防活性的影響 酵母活化和液體培養(yǎng)、菌體收集同 ，幾丁質(zhì)濃度取 %、 %、%和 %（ w/v） ，二代液體培養(yǎng)時間為 24 h，所得酵母細胞懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)后配制成所需濃度備用。 Feng and Zheng, 20xx)。菌種在 4℃ 下保存于 NYDA（葡萄糖 10 g，牛肉浸膏 8 g，酵母粉 5 g，瓊脂20 g，定容至 1000 ml 蒸餾水中， 121℃ 下滅菌 20 min）斜面培養(yǎng)基中。 Tallman （ 1984）。酵母 菌與其他生防菌相比，具有以下優(yōu)點：（ 1）不產(chǎn)生抗菌素，長期使用不會使病原菌對抗菌素產(chǎn)生抗性而降低生物防治效果，還可以避免某些抗生素對人體潛在的不良影響；（ 2）酵母菌能在貧乏營養(yǎng)環(huán)境中快速增殖，干燥情況下可在果蔬表面定殖并存活相當長的時間，能耐受低溫等不良環(huán)境；（ 3）大多數(shù)酵母菌可與一些食品添加劑（鈣鹽、鈉鹽、 EDTA 等）結(jié)合使用，并且能夠耐受一些低劑量化學殺菌劑（涕必靈等），從而減少化學殺菌劑的使用量，提高生防效果。同時 通過減少果實的腐爛 ， 降低 資源浪費 ，減少經(jīng)濟損失，通過拮抗酵母代替 化學殺菌劑的使用，促進農(nóng)村和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟向環(huán)境友好、 生態(tài) 健康的方向發(fā)展 ，因此本項目 不僅具有 廣闊 的經(jīng)濟應用前景， 而且 具有巨大的社會效益和生態(tài)效益。 應用前景和學術(shù)價值 利用拮抗酵母對水果采后病害進行生物防治是目前國內(nèi)外研究的熱點，其 對于保護生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義 。拮抗酵母生防制劑商品化發(fā)展緩慢主要有兩個原因。近年來國際上已有研究采后拮抗酵母的分子特征和利用基因工程改造采后生物防治酵母的研究報道，但總體上成功的報道還很有限。西班牙 XaRTApostharvest 實驗室 的 研究者發(fā)現(xiàn) 經(jīng) 鹽脅迫誘導培養(yǎng)的 P. agglomerans CPA2 在 冷凍干燥或噴霧干燥后，細胞的存活率比未經(jīng)誘導培養(yǎng)的菌株有顯著的提高， 且 凍干粉單獨使用或結(jié)合佐劑 Fungicover 使用，對果實病害的抑制效果均顯著高于未經(jīng)脅迫的新鮮酵母 。因此進入 20 世紀 90 年代以后，拮抗菌的研究重點逐步從拮抗細菌轉(zhuǎn)向了拮抗酵母。 抗生作用 通過拮抗菌產(chǎn) 生抗生素抑制病原菌作用是人們最早發(fā)現(xiàn)的一種拮抗機理，也是大多數(shù)拮抗細菌最主要的機制之一（表 ）（ Janisiewicz and Roitman, 1988。 表 主要產(chǎn)胞外物質(zhì)菌株 誘導抗性 近 5 年來，拮抗 菌 誘導采后果實抗性 成為了生物防治的研 究熱點 。 EIGhaouth（ 20xx） 發(fā)現(xiàn)拮抗菌 C. saitoana 在蘋果傷口處可以緊緊吸附在灰葡萄孢的菌絲上。拮抗菌的快速定植和水果本身酶的誘導作用可能導致了胞外溶解酶的 數(shù)量增加。比如Petersson和 Schnurer（ 1995） 發(fā)現(xiàn) P. anomala能在體外試驗中減少 P. roquefortii和 亮白曲霉 (Aspergillums candidus)的數(shù)量。 營養(yǎng)和空間的競爭還被認為對病原真菌的次級代謝有作用（ Bjornberg and Schnurer, 1993。此外，酵母分泌的胞外多糖也能促進果實表面的粘結(jié)作用從而在空間競爭上占據(jù)優(yōu)勢 (Andrews et al., 1994)。 Filonow（ 1998） 用 14C 標記的果糖、葡萄糖、蔗糖檢驗在蘋果傷口處的拮抗菌羅倫隱球酵母（ C. laurentii）、擲抱酵母（ S. roseus）與病原菌灰葡萄孢孢子在營養(yǎng)利用上的差別，發(fā)現(xiàn)拮抗菌攝取和利用 14C 果糖的量越大，對分生孢子萌發(fā)的抑制作用越強，說明營養(yǎng)競爭是重要的生防機制。 采后拮抗酵母作用機 制 根據(jù)已有的研究結(jié)果顯示，微生物對病原菌有直接作用和間接作用兩種方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，間接作用包括營養(yǎng)和空間的競爭，胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生和誘導抗性等。利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物進行生物防治的方法近 10 年來已經(jīng)取得了突破性的進展， 被認為是最有希望替代化學殺菌劑的方法之一（ Janisiewicz 和 Korsten,20xx） 。 由于低溫貯藏、輻照處理和 熱處理等物理方法都需要特定的設備，這些方法在執(zhí)行起來受到成本、產(chǎn)地、運輸條件等限制。 低溫冷藏是一種常用的 保鮮技術(shù)。 此外由于長期使用殺菌劑，病原菌進化 并 產(chǎn)生了大量抗藥性菌種。 隨著國家經(jīng)濟發(fā)展和消費水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境保護意識的增強，化學殺菌劑的使用范圍越來越受 到 限制。特別是當果蔬受到機械損傷后，病原菌更容易進入傷口，導致病害的發(fā)生，所以有必要利用一些防治手段保護這些損傷位點，防止果蔬在儲運過程中進一步的腐爛變質(zhì)。nchezTorres and Gonz225。最近，中科院植物所 Qin 等 （ 20xx）利用蛋白組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)，硼酸鹽抑制擴展青霉的機理與硼酸鹽抑制該真菌體內(nèi)參與清除 ROS 的過氧化氫酶（ Catalase， CAT）及谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶（ Glutathione Stransferase）等有關(guān)，暗示擴展青霉產(chǎn)生的 CAT 等可能也是該病原菌的一個致病因子。nchezTorres 和 Gonz225。病原真菌分泌產(chǎn)生的寄主細胞壁分解酶是研究較多、機理較為明確的重要致病因子，其主要包括多聚半乳糖醛酸酶（ polygalacturonase）、果膠裂解酶（ pectatelyase）、木聚糖酶（ xylanases）、木糖苷酶（ xylosidase）、蛋白酶（ protease）、葡聚糖酶（ glucanases）、漆酶（ laccase）等 (S225。 哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 第一章 文獻綜述 2 采后病原真菌的侵染方式 采后病原真菌主要通過 3 種途徑或方式入侵果實： (1)通過機械傷或蟲害等造成的傷口； (2)通過自然開放的皮孔、氣孔、果實和花梗結(jié)合部位； (3)通過分泌寄主細胞壁水解酶等直接突破果實表皮的防御機制（ Prusky 和Lichter, 20xx）。真菌也是引起采后果實病害的主要病原物（ Sholberg 和 Conway， 20xx）。據(jù)此估算，我國每年水果采后的經(jīng)濟損失將達到數(shù)百億元人民幣的水平。據(jù) 20xx 年初步統(tǒng)計， 20xx 全國水果面積約 億畝，與上年基本持平，產(chǎn)量 億噸，同比增 9％ 。 BCPD哈爾濱工業(yè)大學學士學位論文 目錄 1 目 錄 摘 要 ...................................................... Ⅰ ABSTRACT ................................................ Ⅱ 第一章 文獻綜述 .............................................. 1 我國水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述 ........................................... 1 果蔬采后病害的侵 染研究 ......................................... 1 采后病原真菌的侵染方式 ................................... 1 采后病原真菌的致病機理 ................................... 2 果蔬采后病害的控制方法 ......................................... 2 化學殺菌劑的使用 ......................................... 3 果實采后病害防治物理方法 ................................. 3 果實采后 病害 生物防治 ..................................... 4 采后拮抗酵母作用機制 ........................................... 4 營養(yǎng)和空間的競爭 ......................................... 4 重寄生作用 ............................................... 5 胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生 ....................................... 5 誘導抗性 ................................................. 6 抗生作用 ................................................. 6 拮抗菌生理調(diào)控及機理的研究 ..................................... 7 逆境培養(yǎng) ............................................