【正文】 ications. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。每處理 3 個(gè)平行，每平行包括 12 個(gè)果實(shí)。在試驗(yàn)果實(shí)的表面用無(wú)菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為 5 mm，深度為 3 mm），每個(gè)傷口處分哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 13 別加入 50 μl下述液體（ 1）無(wú)菌水（作為對(duì)照）；（ 2）在 NYDB 中培養(yǎng) 24 h的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）；（ 3）在幾丁質(zhì)濃度為 %（ w/v）的 NYCB 中分別培養(yǎng) 2 3 4 7 96 h 的 R. paludigenum 懸浮液（ 1108 cells/ml）。l）加入：（ 1） NYDB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 10 10 108 cells/ml）；（ 2） NYDB 培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（ 10 10 108cells/ml）；（ 3）無(wú)菌水（作為對(duì)照）。選取外觀飽滿，無(wú)機(jī)械傷口、無(wú)病蟲害、無(wú)感染，大小和成熟度均勻一致的果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，用 %次氯酸鈉溶液浸泡消毒 1~2 min、用自來(lái)水沖洗、并在室溫下放干（ 20℃ ~25℃ ）后備用。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 主要儀器 TH3560 全自動(dòng)滅菌鍋 造鑫 (TSAO HSIN)企業(yè)有限公司 SWCJ1F 超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 SIGMA 3K15 離心機(jī) 德國(guó)希格瑪（ SIGMA）公司 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 11 QYC211 全溫空氣搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 Sartrious 電子天平 北京賽多利斯天平 有限公司 200 ?l、 1000 ?l、 5ml移液器 德國(guó) Eppendorf 公司 血球計(jì)數(shù)板（ 2516） 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠 光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司 LRH250 生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司 拮抗菌及其培養(yǎng) 拮抗菌 Rhodosporidium paludigenum，分離自中國(guó)東海近海 海域，并經(jīng)英國(guó)國(guó)際微生物所菌種保存和鑒定中心（ CABI Bioscience Identification Services）鑒定。 近年來(lái)，果蔬采后病害生物防治的研究重點(diǎn)是酵母菌。研究幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后 R. paludigenum 對(duì)蘋果、梨采后主要真菌病害擴(kuò)展青霉（ P. expansum）體內(nèi)的抑制效果，篩選出最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間，并結(jié)合其他誘導(dǎo)因子為蘋果、梨采后病害提供一種安全、經(jīng)濟(jì)有效的防治方法， 并對(duì)可哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 9 能存在的相關(guān)機(jī)理，包括促進(jìn)酵母菌生長(zhǎng)、分泌抗菌物質(zhì)和誘導(dǎo)抗性等進(jìn)行系統(tǒng)研究。 基因工程技術(shù) 的應(yīng)用 利用分子生物學(xué)和基因工程的手段研究拮抗菌的遺傳背景并開展相 應(yīng)分子水平的改造是生物防治領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，通過(guò)基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)化具有抑制病原真菌活性的蛋白和代謝產(chǎn)物也是提高拮抗酵母效力的重要途徑（ Janisiewicz 和 Korsten， 20xx），但其前提是拮抗微生物遺傳背景的明確、轉(zhuǎn)化方法的建立和轉(zhuǎn)化目標(biāo)的確定等。而且能在寄主上保持拮抗能 力的細(xì)菌仍具有兩個(gè)弊?。菏紫?，抗生素有可能誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性，從而逐步降低拮抗菌對(duì)病害的控制效果；其次，拮抗菌產(chǎn)生的抗生素對(duì)食用者也可能產(chǎn)生不利影響。這些胞外活性物質(zhì)可能參與了拮抗菌與病原哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 6 菌之間的相互 作用（表 ）。出芽短梗霉 （ A. pullulans） 能顯著抑制蘋果等水果采后多種病原菌， Castoria R 和 Ippolito A 等 （ 20xx） 在出芽短梗霉 （ A. pullulans） 處理過(guò)的蘋果傷口上檢測(cè)到了濃度更高的 β1,3葡聚糖酶和幾丁酶活性。這也反映了營(yíng)養(yǎng)與空間的競(jìng)爭(zhēng)可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要機(jī)理之一。 拮抗菌與病原菌爭(zhēng)奪的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要是碳水化合物、氮源等。例如在美國(guó)，有機(jī)產(chǎn)品的產(chǎn)值已從 1997 年的 億美元增長(zhǎng)到了 20xx 年 145 億美元（ Prange et al., 20xx）。低溫冷藏技術(shù)已經(jīng)在部分地區(qū)得到實(shí)際運(yùn)用，熱殺菌和輻照殺菌也是目前報(bào)道比較多的方法?；瘜W(xué)殺菌劑在全世界范圍廣泛使用，在歐洲和亞洲占農(nóng)藥市場(chǎng)的 26%，但在美國(guó)只占6%。 S225。 這些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染機(jī)制和過(guò)程，如滲透、組織泡軟、營(yíng)養(yǎng)獲得、改變寄主生理等 （ S225。病原真菌不僅會(huì)造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可 能引起嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。根據(jù)一般保守的估計(jì)，我國(guó)水果采后損失為20%～ 30％左右。 Induction。而未經(jīng)誘導(dǎo) R. paludigenum 的發(fā)酵上清液對(duì)蘋果果實(shí)傷口處擴(kuò)展青霉的侵染沒(méi)有抑制作用，反而有促進(jìn)效果。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用酵母細(xì)胞壁組分之一 幾丁 質(zhì)誘 導(dǎo)培 養(yǎng)本 實(shí)驗(yàn) 室分 離得到 的拮 抗菌 株海 洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell amp。 作者簽名： 日 期： 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 摘要 II 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。 作 者 簽 名： 日 期： 指導(dǎo)教師簽名： 日 期： 使用授權(quán)說(shuō)明 本人完全了解 大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用畢業(yè)設(shè)計(jì)（ 論文）的規(guī)定，即：按照學(xué)校要求提交畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）的印刷本和電子版，并提供目錄檢索與閱覽服務(wù)；學(xué)?？梢圆捎糜坝　⒖s印、數(shù)字化或其它復(fù)制手段保存論文；在不以贏利為目的前提下，學(xué)?？梢怨颊撐牡牟糠只蛉?jī)?nèi)容。 作者簽名： 日期： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 日期： 年 月 日 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 摘要 III 摘 要 生物防治是采用微生物菌株或抗菌素類物質(zhì)，通過(guò)噴灑或浸漬果實(shí)處理，以降低或防治果實(shí)采后病害的保鮮方法。 （ 4）幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后， R. paludigenum 的發(fā)酵上清液對(duì)蘋果果實(shí)傷口處擴(kuò)展青霉的侵染有一定抑制作用。 Chitin。我國(guó)水果因采后處理技術(shù)落后，作為產(chǎn)量第一大國(guó)，水果腐爛 損失也高居全球榜首。 果蔬采后病害的侵染研究 由真菌病害引起的果實(shí)采后的腐爛變質(zhì)是導(dǎo)致水果大量損失的主要原因之一。lezCandelas， 20xx； Akimitsu et al., 20xx)。另一方面，病原真菌在侵染過(guò)程中能誘導(dǎo)激發(fā)果實(shí)組織的形態(tài)和生理、分子水平發(fā)生顯著變化（ Kim et al., 20xx。 化學(xué)殺菌劑的使用 目前，化學(xué)殺菌劑是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一。 果實(shí)采后病害 物理 防治 果蔬采后病害防治物理方法主要有：熱處理；低溫冷藏 ； 微波處理；氣調(diào)；輻射處理；低壓處理。 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 果實(shí)采后 病害 生物防治 從可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，開發(fā)新型、高效且安全的有機(jī)、綠色的保鮮劑具有重大的社會(huì)意義和廣闊的應(yīng)用前景。 營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng) 為了抑制病原菌的侵染 , 拮抗菌必須在病原菌到達(dá)以前或到達(dá)以后的很短時(shí)間內(nèi)在果實(shí)表面侵染部位占據(jù)優(yōu)勢(shì)。 Fan and Tian, 20xx） 。 Gravese 等（ 1998）報(bào)道 P. anomala K 對(duì)抑制蘋果灰霉病非常有效，因?yàn)榛移咸焰呒?xì)胞壁能誘 導(dǎo) 其在 蘋果傷口上 分泌的胞外 β1,3葡聚糖酶的量增加 3 倍。 胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生 一些研究結(jié)果顯示，拮抗菌與病原菌互作時(shí) , 在果實(shí)傷口部位生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞外圍有大量的新生物質(zhì)。但是，在體外試驗(yàn)中能產(chǎn)生抗生素的菌株中很大一部分不能在體內(nèi)試驗(yàn)中產(chǎn)生抑菌效果，這是由兩方面的原因造成的：有些細(xì)菌只能在“ in vitro”環(huán)境中產(chǎn)生抗生素，而在“ in vivo”則不產(chǎn)生抗菌素；一些細(xì)菌不適應(yīng)寄主傷口的環(huán)境，不能存活或生命力下降，因此不能產(chǎn)生很好的拮抗效果。 Li等（ 20xx， 20xx）報(bào)道通過(guò)海藻糖培養(yǎng)羅倫隱球酵母（ C. laurentii）后能在該酵母細(xì)胞內(nèi)積累較高水平的海藻糖，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)這種處理后羅倫隱球酵母控制蘋果青霉病的效力顯著增強(qiáng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種處理還能提高該酵母在凍干后的存活率。 本試驗(yàn)?zāi)康氖墙鉀Q瓶頸問(wèn)題之一，探討通過(guò)在培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)等培養(yǎng)酵母 R. paludigenum 提高其拮抗效力的可行性，以提高酵母的生防效果。哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 10 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 前言 生物防治是采用微生物菌株或抗菌素類物質(zhì)，通過(guò)噴灑或浸漬果實(shí)處理，以降低或防治果實(shí)采后病害的保鮮方法。 本實(shí)驗(yàn)主要研究幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后 R. paludigenum 對(duì)蘋果、梨采后主要真菌病害擴(kuò)展青霉（ P. expansum）體內(nèi)的抑制效果，篩選出最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間，并結(jié)合其他誘導(dǎo)因子為蘋果、梨采后病害提供一種安全、經(jīng)濟(jì)有效的防治方法。 果實(shí)選擇與預(yù)處理 試驗(yàn)所用果實(shí)為正常商業(yè)成熟度的蘋果 (Malus domestica)果實(shí)，品種為紅富士；梨（ Pyrus pyrifolia Nakai）果實(shí)，品種為水晶。每個(gè)傷口處等量（ 50 181。 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)幾丁質(zhì)誘導(dǎo) 拮抗酵母生防活性的影響 酵母活化和液體培養(yǎng)、菌體收集同 ，幾丁質(zhì)濃度取 %（ w/v） ，二代液體培養(yǎng)時(shí)間分別為 2 3 4 7 96 h，所得酵母細(xì)胞懸浮液用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后配制成所需濃度備 用。用 PE 塑料膜密封作保濕處理，并在室溫（ 20~25 ℃ ）下貯藏，每天定時(shí)記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（ %）和病斑直徑（ mm）表示。 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母 R. paludigenum 對(duì)果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究 14 6d 7d020406080100cbcbcdbcdbcdbccbaDisease incidence (%)D ay s af t er i nocul at i on(d) C ont rol N Y D B N Y C B ( 0. 1%) N Y C B ( 0. 2%) N Y C B ( 1. 0%) N Y C B ( 2. 0%)a 圖 21 不同濃度幾丁質(zhì)培養(yǎng)后的 R. paludigenum 對(duì)梨青霉病的抑制效果 Fig. 21 Incidence of blue mold decay caused by Penicillium expansum on pears inoculated with R. paludigenum cultured with different concentrations of chitin. Bars represent standard errors of three replications. Different letter indicates significant differences (P ) according to the Duncan39。 B: R. paludigenum cultured in NYDB with % chitin。 107C: %幾丁質(zhì) NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1107cell/ml） 。 107N: NYDB 培養(yǎng)的 R. paludigenum（ 1107cell/ml）