【正文】 最后要特別感謝趙晴瀟老師在實(shí)驗(yàn)過程中給予的指導(dǎo)和鼓勵(lì)，沒有您的指導(dǎo)就沒有這篇畢業(yè)論文，謝謝！。作為 β半乳糖苷酶的酶反應(yīng)終產(chǎn)物，半乳糖也可以在某種程度上對(duì)β半乳糖苷酶進(jìn)行產(chǎn)物抑制，從而 β半乳糖苷酶構(gòu)象的改變。在半乳糖作為 β半乳糖苷酶的保護(hù)劑的作用下，固定化過程也相對(duì)穩(wěn)定地進(jìn)行了下來。表49 固定化酶保護(hù)劑的篩選保護(hù)劑蔗糖果糖乳糖半乳糖葡萄糖麥芽糖固定化酶活力由上述結(jié)果可知，在乳糖的保護(hù)下 β半乳糖苷酶的固定化可進(jìn)行得更徹底，能更好地保護(hù) β半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)，減小固定化過程對(duì)酶活的影響。 固定化酶保護(hù)劑的篩選根據(jù)前面各步驟所得的最適反應(yīng)條件設(shè)定固定化條件，在固定化前分別向固定化體系中添加保護(hù)劑：蔗糖，果糖，乳糖，半乳糖，葡萄糖，麥芽糖各2ml，濃度均為 1mg/ml， 添加后進(jìn)行固定化反應(yīng)，測量游離酶量，固定化酶的活力及活力回收率。這三種效應(yīng)的產(chǎn)生都是由于酶和固定化載體發(fā)生了相互作用，因此主要取決于固定化的條件和方法，但部分也取決于載體的性質(zhì)。外擴(kuò)散是發(fā)生在固定化酶表面周圍的能斯特層，由底物從大環(huán)境主體溶液中向固定化酶表面?zhèn)鬟f引起，它使得底物在固定化酶周圍形成濃度梯度，隨攪拌速度增加而減少；內(nèi)擴(kuò)散阻力發(fā)生在多孔固定化酶載體的內(nèi)部、底物或其它效應(yīng)物在載體顆粒表面與載體內(nèi)的酶活性部位間運(yùn)轉(zhuǎn)過程中的擴(kuò)散限制。分配效應(yīng)使得底物或其他各種效應(yīng)物在微環(huán)境與大環(huán)境之間不均勻分布，從而影響酶反應(yīng)速度，實(shí)驗(yàn)測定的是大環(huán)境的濃度，而反應(yīng)本質(zhì)行為的是微環(huán)境中的濃度。 影響固定化酶的動(dòng)力學(xué)因素前一種影響是酶分子在固定化過程中發(fā)生了某種扭曲，可能使酶分子拉長，改變酶活性部位的三維結(jié)構(gòu)，從而改變酶活性，這兩種原因都直接導(dǎo)致了酶與底物結(jié)合能力或酶催化底物轉(zhuǎn)化能力的改變，而影響酶活性。通?；|(zhì)溶于連續(xù)相水中，固定化酶懸浮于其中，以單基質(zhì)反應(yīng)為例(S—P)，基質(zhì)S從反應(yīng)液主體傳遞到固定化酶微粒外表面，然后擴(kuò)散到粒子的酶分子上，而生成物P則剛好與此途徑相反?？芍潭ɑ概c游離酶的最適溫度都在35~40℃范圍內(nèi)。在pH6或pH7時(shí)，固定化酶活力迅速下降，可能是過酸或過堿的環(huán)境使酶的活性中心部位基團(tuán)發(fā)生了不可逆的變化。圖464 戊二醇濃度對(duì)固定化酶酶活的影響 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì) 固定化酶的最適pH在兩支試管中各加入5mL ONPG底物溶液，在不同pH(3，4，5，6，7，8，9)下反應(yīng)10min滅活，測吸光值，計(jì)算相對(duì)酶活，結(jié)果見圖471。起初取1%，2%，3%，4%，5%戊二醛作為交聯(lián)劑，反應(yīng)后發(fā)現(xiàn)溶液無顯著變色現(xiàn)象，表明高濃度的戊二醛將導(dǎo)致酶活力下降，這可能是因?yàn)槊阜肿踊钚曰鶊F(tuán)被戊二醛過多地修飾，%，%，%，%的戊二醛作為交聯(lián)劑，將lmL酶液和海藻酸鈉混合液滴入由10mL CaCl2溶液和l0mL戊二醛溶液組成的混合溶液中，反應(yīng)15min，結(jié)果見圖464，%時(shí)聯(lián)合固定化酶的活力最高，交聯(lián)劑濃度過高時(shí)，使酶本身變性失活，酶活力下降。在實(shí)際應(yīng)用中，一種固定方法常不能達(dá)到理想的結(jié)果，往往幾種固定方法聯(lián)合使用。當(dāng)固定化時(shí)間為0時(shí)，珠體破碎溶解，無法測酶活。圖462 CaCl2濃度固定化酶酶活的影響 固定化時(shí)間的確定取4％的海藻酸鈉與酶液各10mL，混勻靜置1h，取6個(gè)燒杯各加入20mL l％CaCl2溶液，分別用注射器吸取1mL混合液滴入燒杯中，在不同時(shí)間(0，1h，2h，)抽濾得固定化酶，酶與底物精確反應(yīng)10min，加入Na2CO3溶液中止反應(yīng)，測酶活。圖461 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶酶活的影響 CaCl2濃度的確定分別配置濃度為1%，2%，3%，4%，5%的CaCl2溶液各20mL置于燒杯中，在相同條件下用4％海藻酸鈉進(jìn)行酶固定化處理，固定時(shí)間為1h，固定化酶與底物精確反應(yīng)10min，加入Na2CO3溶液中止反應(yīng)，測吸光值，結(jié)果見462。可知海藻酸鈉固定化酶的酶活有不同程度損失，海藻酸鈉濃度低時(shí)，酶泄漏嚴(yán)重，清洗酶珠時(shí)，酶損失較多，酶活力下降，海藻酸鈉濃度高時(shí)，微環(huán)境效應(yīng)和擴(kuò)散陰力對(duì)反應(yīng)影響更大。4%，5%的海藻酸鈉，各取5mL，放置于5個(gè)燒杯中，每個(gè)燒杯中各加入5mL酶液，混勻靜置30min，用注射器吸取lmL混合液逐滴滴入20mL 2％的CaCl2溶液中，于室溫下固定30min，用蒸餾水洗滌，抽濾三次，獲得固定化酶。 固定酶活力測定，只是不加游離酶，而加固定化酶。本文以海藻酸鈉為包埋載體，戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)乳糖酶進(jìn)行固定化嘗試，探討了固定化的最適條件及固定化酶的部分性質(zhì)。潘道東(1991)，用卡拉膠包埋法制備固定化脆壁酵母β半乳糖苷酶，活力回收率可達(dá)83%，可以在實(shí)驗(yàn)條件下有效水解乳清、脫脂乳和全脂乳中的乳糖，在45℃下，水解半衰期均在1 69200小時(shí)，但是卡拉膠的機(jī)械強(qiáng)度差，不適合工業(yè)化應(yīng)用。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Ea、Km變大，Vmax變小。凍干固定化酶室溫保存60天，仍具有較高活力，重復(fù)使用數(shù)次后，仍具有操作穩(wěn)定性，酶活力沒有損失。李緒淵等人將來自鷹嘴豆B一半乳糖苷酶固定在聚丙烯酰胺上，活力回收率為72%。 國內(nèi)研究進(jìn)展我國的學(xué)者對(duì)β半乳糖苷酶的固定化也展開了一些研究，但尚未見到進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖奶的報(bào)道。Millert根據(jù)乳糖酶與乳糖分子的大小不同，牛奶先經(jīng)過超濾，濾過液(主要是乳糖)與乳糖酶在反應(yīng)器中反應(yīng)，然后再經(jīng)過一次超濾，乳糖、葡萄糖、半乳糖等小分子物質(zhì)通過，而大分子的乳糖酶被截流住，重新回到反應(yīng)器中繼續(xù)循環(huán)使用，第二次的濾過液和第一次的濾過液混合，就制成低乳糖牛奶。、30~35℃的條件下處理濃縮乳清，乳清濃縮程度取決于終產(chǎn)物的抑制作用和反應(yīng)器的壓降，所用固定化酶的裝置曾成功地運(yùn)轉(zhuǎn)了兩年。用纖維素包埋酵母乳糖酶已有工業(yè)規(guī)模應(yīng)用，用其間歇處理預(yù)先超高溫消毒的牛奶。固定化細(xì)胞在4℃儲(chǔ)存2個(gè)月，水解效率不變。Tomoska和Gemeiner(1995)選用聚乙烯亞胺和戊二醛活化的果膠酸鈣(CPG)和海藻酸鈣(CAG)作載體固定克魯維酵母屬M(fèi)arxianus CCYeSY2。固定化酶水解乳糖的最適pH和最適溫度同游離酶相同。固定化酶的特性幾乎與游離酶相同，在巴氏消毒牛奶中65℃固定化酶的半衰期為450小時(shí)，體現(xiàn)了工業(yè)用于生產(chǎn)低乳糖牛奶的前景。具體結(jié)果如表4所示：固定化方法Vmax（u/ml）Km（mM）相對(duì)活性（%）酶活力（U）GCP交聯(lián)法GCP芳香胺交聯(lián)法卡拉膠包埋法物理吸附法游離酶//可見GCP一醛交聯(lián)法效果最好。圖434 中空纖維反應(yīng)器 固定化乳糖酶國內(nèi)外研究進(jìn)展 國外研究進(jìn)展美國、日本、意大利等國對(duì)固定化β半乳糖苷酶分解乳糖進(jìn)行了廣泛的研究。此外還有螺旋卷膜式反應(yīng)器以及不同反應(yīng)器結(jié)合的類型，但并不存在一種通用的、理想的反應(yīng)器。另一種方式是把酶保留在纖維的外側(cè)，而底物則流經(jīng)纖維內(nèi)腔。例如，酶可被包埋于中空纖維內(nèi)，然后再把纖維束放置于反應(yīng)器內(nèi)。它可以提供較大的催化表面，結(jié)構(gòu)類似于列管換熱器。目前，流化床反應(yīng)器主要被用來處理一些粘度高的液體和含有固體顆粒的底物，如用于水解牛奶中的蛋白質(zhì)。底物以一定的流速從下向上流過，使固定化酶顆粒在流體中維持懸浮狀態(tài)并進(jìn)行反應(yīng)，這時(shí)的固定化顆粒和流體可以看作是均勻混合的流體。適合于存在有產(chǎn)物抑制的催化反應(yīng)。它具有單位體積的催化劑負(fù)荷高、結(jié)構(gòu)簡單、容易放大、剪切力小、催化效率高等優(yōu)點(diǎn)。圖431 連續(xù)操作攪拌式反應(yīng)器(Packed Bed Reactor，PBR)把固定化顆粒填充在固定床(填充床)中的反應(yīng)器叫做固定床反應(yīng)器，如圖432所示。此外還可將載有酶的圓片聚合物，固定在攪拌軸上或者將固定化酶放置在與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動(dòng)的金屬網(wǎng)筐內(nèi)，這樣既能保證反應(yīng)液攪拌均勻，同時(shí)又不致?lián)p壞固定化酶。其缺點(diǎn)是由于攪拌漿產(chǎn)生的剪切力較大，常會(huì)引起固定化酶的破壞。表42為各種酶的固定化方法比較：表42 固定化方法及優(yōu)劣比較方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)吸附法制作條件溫和、簡便、成本低、可再生、可反復(fù)利用結(jié)合力弱，對(duì)pH、離子強(qiáng)度、溫度等因素敏感，酶易脫落，酶的裝載容量較小包埋法包埋材料、包埋方法可選擇余地大，固定化酶的使用面廣，包埋條件溫和僅可用于低分子量的底物，不適用于柱系統(tǒng)，常有擴(kuò)散限制問題共價(jià)法載體與歐聯(lián)方法可選擇性大；酶的結(jié)合力強(qiáng)，非常穩(wěn)定偶聯(lián)條件激烈，易引起酶失活，成本高，某些偶聯(lián)試劑有一定毒性交聯(lián)法可用的交聯(lián)試劑多，技術(shù)簡易，酶的結(jié)合力強(qiáng)，穩(wěn)定性高交聯(lián)條件激烈，機(jī)械性差 固定化酶反應(yīng)器的類型(Continuous Flow Stirred Tand Reactor，CSTR)該反應(yīng)器內(nèi)裝有攪拌器，能使反應(yīng)組分與固定化酶顆?；旌暇?，如圖431所示。因此，對(duì)任何一種酶的固定化，其載體和方法的選擇都更多的依賴實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與共價(jià)結(jié)合法一樣，由于酶的功能團(tuán)(如氨基、巰基和咪唑基)參與反應(yīng)可能引起酶活性中心結(jié)構(gòu)的改變，使酶活力下降。交聯(lián)法又稱為架橋法，是借助于雙功能或多功能試劑與酶分子中的氨基或羧基發(fā)生反應(yīng)，使酶蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)，結(jié)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而制成固定化酶。 吸附法通過非特異性物理吸附法或生物物質(zhì)的特異吸附作用將酶固定到載體(如硅藻土、陶瓷、塑料等)表面，方法簡便，酶活力不受影響，但是吸附的靜電作用力容易受到反應(yīng)液中pH的影響。 酶的固定方法 包埋法載體(如聚丙烯酰胺凝膠、矽酸鹽凝膠、藻酸鹽、角叉菜聚糖等)在有酶的存在下發(fā)生聚合、沉淀或凝膠化。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，又克服了游離酶的不足之處，呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)可控、工藝簡便等一系列優(yōu)點(diǎn)。固定化酶的研究始于 1910 年，正式研究于 20 世紀(jì)